【摘 要】
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摘要[目的]体外通过腺相关病毒将目的基因TGF-β3和TIMP-1转染兔骨髓间充质干细胞诱导其向软骨表型转化,进而通过藻酸盐凝胶复合转染成功的兔骨髓间充质干细胞植入兔关节软骨缺损处,修复兔关节软骨急性缺损。[方法]无菌条件下冲出兔股骨和胫骨髓腔骨髓液,进行原代和传代培养,取第三代对数生长期骨髓间充质干细胞以2.5×105/ml接种于六孔板上,进行携带目的基因的重组腺相关病毒梯度转染,将转染后3,6
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摘要[目的]体外通过腺相关病毒将目的基因TGF-β3和TIMP-1转染兔骨髓间充质干细胞诱导其向软骨表型转化,进而通过藻酸盐凝胶复合转染成功的兔骨髓间充质干细胞植入兔关节软骨缺损处,修复兔关节软骨急性缺损。[方法]无菌条件下冲出兔股骨和胫骨髓腔骨髓液,进行原代和传代培养,取第三代对数生长期骨髓间充质干细胞以2.5×105/ml接种于六孔板上,进行携带目的基因的重组腺相关病毒梯度转染,将转染后3,6,9,12天细胞裂解提取蛋白通过酶联免疫（Elisa）检测目的蛋白TGF-β3的检测表达。TRIZOL法提取细胞mRNA,半定量RT-PCR从基因水平检测前两周Ⅱ型胶原的表达,免疫印迹western blot从蛋白水平检测前两周Ⅱ型胶原的表达,甲苯胺蓝染色检测前两周蛋白多糖的表达。体外验证兔骨髓间充质干细胞可以成功的通过内源性诱导向软骨表型转化后,再通过藻酸盐凝胶复合转染成功的兔骨髓间充质干细胞植入兔关节软骨缺损处,两月后处死家兔,大体观察以及HE染色评定缺损软骨修复情况。[结果]重组腺相关病毒转染后,骨髓间充质干细胞可以较稳定的表达目的蛋白TGF-β3以及TIMP-1,RT-PCR结果从第一周起可以看到实验组Ⅱ型胶原基因条带的表达,甲苯胺蓝染色可以看到从一周后起细胞胞浆和胞核内蓝染明显,第二周染色更为明显,western-blot第一周起可以检测到有微弱的Ⅱ型胶原蛋白的表达,第二周表达更为明显,以上结果从基因水平和蛋白水平都较为一致,联合转染组的各项检测指标表达量均较实验组稍大。动物实验中,两月后,各个实验组兔关节软骨缺损处均有白色软骨样物质生成,联合转染组诱导的软骨更接近透明软骨,联合转染组评分与单纯TGF-β3转染组差异具有统计学意义（P<0.01）。HE染色结果提示联合转染组较单纯TGF-β3转染组软骨修复效果佳。[结论]单纯TGF-β3通过腺相关病毒载体转染骨髓间充质干细胞可以成功诱导干细胞向软骨表型分化,联合转染组诱导分化效果更好证实TIMP-1与TGF-β3具有协同作用,动物实验中TGF-β3,TIMP-1联合转染兔骨髓间充质干细胞复合藻酸盐凝胶修复兔软骨缺损效果良好。
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