产单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种强致病性的食源性病原菌,已被WHO列为4种主要的食源性疾病之一,建立对该菌的快速、敏感、特异的检测方法是目前亟待解决的问题之一。LM的致病性与多种毒力因子有关,其中溶血素O(Listeriolysin O, LLO)是该菌的主要毒力因子,它存在于所有的致病性LM中。LLO是一种能结合胆固醇、可被巯基活化的细胞溶解素,由hlyA基因编码。本研究根据产单核细胞李斯特菌hlyA基因设计引物,进行PCR扩增,检测该方法的特异性和灵敏度。人工污染样品经Half-fraser和Fraser增菌后进行PCR检测,结果表明,产单核细胞李斯特菌扩增出234bp的条带,对照菌未扩增出目的条带,该方法的灵敏度为104 cfu/mL。人工污染样品的检出限为8 cfu/25g。说明PCR方法检测食品中产单核细胞李斯特菌具有快速、特异、敏感等特点,具有较高的实用价值。利用PCR技术扩增产单核细胞李斯特菌溶血素基因hlyA,将其与pMD18-T载体连接,重组质粒经酶切、PCR鉴定后命名为pMD18-T-hlyA。重新设计带BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点引物,从pMD18-T-hlyA扩增不含信号肽序列的目的片断,与pET32a载体连接。通过酶切、PCR鉴定及序列测定后,重组菌pET32a-hlyA用IPTG诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE,纯化后进行Western blot和间接ELISA分析。结果表明,所扩增的hlyA基因与GenBank中发表的hlyA的序列的同源性为99%,重组菌在大肠埃希菌BL21中表达了80ku左右的融合蛋白,经可溶性分析该蛋白以包涵体形式存在,能被LM阳性血清所识别,这为进一步研制单抗、建立间接ELISA诊断方法提供了条件。