肺癌作为世界上发病率和死亡率均居高位的癌症,其85%的发病类型为非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）。尽管近年来已经开发出许多NSCLC的治疗策略,如手术治疗、放化疗、光动力疗法、分子靶向治疗等。然而,由于早期诊断率低,大部分患者在临床确诊时肿瘤已经发生转移,同时由于放化疗的副作用严重,分子靶向药物易产生耐药,导致NSCLC的整体治疗效果仍不尽如人意,患者五年生存率仅为15%,因此迫切需要研究新的治疗药物和开发新的治疗策略。近年来,许多研究发现中草药及其提取物具有优秀的抗肿瘤潜力,中草药及其活性成分已经成为抗肿瘤研究的热点。鸦胆子苦醇（Brusatol）是一种从传统中药鸦胆子中提取出的活性单体成分,研究已经证实其具有优秀的抗肿瘤能力,包括抑制肿瘤细胞的增殖、减弱肿瘤细胞的迁移侵袭、诱导肿瘤细胞的凋亡、增强肿瘤细胞对化疗药物和放疗射线的敏感性。虽然已有研究发现鸦胆子苦醇对部分NSCLC细胞株有抑制作用,但其具体作用和机制尚未深入研究。整合素（integrin,ITG）是一类广泛存在于几乎所有细胞表面的跨膜黏附受体,调控着许多细胞的生物学行为,包括细胞黏附、增殖、生长、凋亡等。整合素α6（ITGA6）作为整合素家族的一员,已经有研究证实ITGA6在肺癌中发挥着重要的调控作用,是NSCLC的潜在治疗靶标。目的:在本研究中,选取人NSCLC细胞系H1299细胞和A549细胞为研究对象,研究鸦胆子苦醇在体外对NSCLC细胞的增殖、迁移侵袭和凋亡的影响,并进一步探寻其分子机制。同时构建A549细胞裸鼠皮下移植瘤模型来探寻鸦胆子苦醇在体内对NSCLC细胞的影响及其机制。方法:体外培养A549和H1299细胞,CCK-8法检测鸦胆子苦醇对NSCLC细胞活力的影响并确认其不同作用时间的IC50,选取最佳作用时间和药物浓度;EdU染色和克隆形成实验检测鸦胆子苦醇对NSCLC细胞体外增殖和克隆形成的影响;划痕实验和Transwell实验探究鸦胆子苦醇对NSCLC细胞迁移和侵袭的影响;流式细胞术测定鸦胆子苦醇对NSCLC细胞周期和凋亡的影响;JC-1线粒体膜电位荧光染色观察鸦胆子苦醇对两种细胞系线粒体的影响;免疫荧光染色观察AIF蛋白质在细胞内的定位情况;构建A549裸鼠移植瘤模型并分为两组,对照组:腹腔注射生理盐水（0.2 m L.2d×28d）;鸦胆子苦醇处理组:腹腔注射鸦胆子苦醇(2 mg.kg-1.2d×28d),研究鸦胆子苦醇在体内对NSCLC细胞的影响;HE染色观察各组模型裸鼠肝、肾以及瘤体的形态学变化;免疫组化染色观察瘤体细胞中Ki67表达水平变化;TUNEL染色观察鸦胆子苦醇对两种细胞系以及裸鼠移植瘤瘤体细胞的胞核DNA的影响;RT-q-PCR检测ITGA6 m RNA在两种NSCLC细胞系与正常肺上皮细胞BEAS-2B细胞中的表达差异以及在经过鸦胆子苦醇处理后ITGA6m RNA在两种NSCLC细胞中的表达水平变化;Western Blot法检测细胞中凋亡、迁移侵袭相关蛋白,ITGA6蛋白,PI3K/AKT通路蛋白以及胞质、胞核中的AIF蛋白的表达水平;免疫共沉淀实验（CO-IP）检测A549、H1299细胞中ITGA6蛋白质与PI3K/AKT通路的相互作用。结果1.CCK-8结果发现:不同浓度鸦胆子苦醇（0、31.25、62.5、125、250、500、1000 nmol/L）分别处理A549和H1299细胞12 h、24 h、48 h后,两种细胞活力明显降低,且呈时间和药物浓度依赖,其在24 h的半数抑制浓度(IC50)分别为0.31μM和0.67μM;2.EdU染色和克隆形成实验表明:鸦胆子苦醇以药物浓度依赖抑制两种NSCLC细胞的增殖和克隆形成;3.划痕和Transwell实验表明:鸦胆子苦醇处理可减弱两种NSCLC细胞的迁移和侵袭能力;4.流式细胞术结果表明:鸦胆子苦醇诱导A549和H1299细胞G0/G1期阻滞和凋亡;5.JC-1荧光染色发现:鸦胆子苦醇处理降低了两种NSCLC细胞的线粒体膜电位;6.TUNEL染色发现:鸦胆子苦醇处理诱导两种NSCLC细胞DNA断裂并发生凋亡;7.免疫荧光定位AIF蛋白质发现:鸦胆子苦醇处理两种细胞后,AIF蛋白质水平在胞质内降低,而在胞核内升高;8.RT-q-PCR与Western Blot结果显示:A549与H1299细胞中ITGA6的m RNA和蛋白质水平明显高于BEAS-2B细胞;9.Western Blot实验结果表明:鸦胆子苦醇处理两种NSCLC细胞后,Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、MMP2、MMP9、N-cadherin、ITGA6、p-PI3K、p-Akt及胞质中AIF蛋白质水平降低,Bax、Cleved-Caspase-3、Cleved-Caspase-9、E-cadherin及胞核中AIF蛋白质水平升高;10.CO-IP实验发现:在A549和H1299两种NSCLC细胞中,ITGA6蛋白质与PI3K/AKT通路存在相互转导;11.体内实验发现:鸦胆子苦醇腹腔注射对模型裸鼠体重无明显影响,但可抑制裸鼠皮下移植瘤的生长。免疫组化染色发现鸦胆子苦醇处理组瘤体中Ki67表达明显降低。HE染色发现鸦胆子苦醇处理组裸鼠的肝肾形态与对照组无明显区别,但瘤体细胞出现核固缩和核碎裂等明显的凋亡特征。同时,TUNEL染色也发现鸦胆子苦醇处理组的瘤体细胞DNA发生明显的断裂。Western Blot实验对各组瘤体组织蛋白进行检测发现,鸦胆子苦醇处理组中ITGA6、p-PI3K、p-AKT的蛋白质水平明显低于对照组。结论1.在体外,鸦胆子苦醇以时间和药物浓度依赖抑制NSCLC细胞A549和H1299细胞的增殖。在A549裸鼠移植瘤模型中,腹腔注射鸦胆子苦醇(2 mg.kg-1.2d×28d)能够明显减缓瘤体的生长速度。2.鸦胆子苦醇处理使得两种NSCLC细胞中Bcl-2/Bax的比值降低,线粒体膜电位降低,AIF从线粒体释放进入胞质,进而被转运入核,导致DNA损伤,同时Cytc从受损线粒体释放,激活Caspase-3和Caspase-9,最终使得肿瘤细胞发生凋亡。3.鸦胆子苦醇使迁移侵袭相关蛋白MMP2、MMP9和N-cadherin水平降低,E-cadherin水平升高,从而削弱NSCLC细胞的迁移和侵袭能力。4.ITGA6在A549和H1299两种NSCLC细胞中高表达,是NSCLC潜在的治疗靶标,同时ITGA6与PI3K/AKT信号通路存在相互转导,调控着NSCLC细胞的各种恶性行为。鸦胆子苦醇能够通过下调NSCLC细胞内ITGA6的表达并抑制PI3K/AKT信号通路的激活。