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研究背景和目的:自新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）引起的新型冠状肺炎（coronavirus disease 2019,COVID-19）疫情爆发以来,全球人类的生命安全与健康受到重创。SARS-CoV-2表面刺突蛋白（spike protein,S）由S1和S2两个亚基组成,SARS-CoV-2通过其S1亚基上的受体结合域（receptor binding domain,RBD）结合宿主细胞膜上的受体血管紧张素转化酶2（angiotension converting enzyme 2,ACE2）,进而诱导病毒和细胞膜融合感染宿主细胞。SARS-CoV-2中和抗体的主要中和机制是通过抗体结合病毒表面刺突蛋白上的RBD从而阻断病毒与ACE2结合后感染宿主细胞,因此RBD蛋白成为了SARS-CoV-2中和抗体的主要靶点。SARS-CoV-2在传播过程中演变成不同的突变毒株,包括阿尔法（B.1.1.7）、贝塔（B.1.351）、伽马（P.1）、卡帕（B.1.617）、德尔塔（B.1.617.2）、兰布达（C.37）、缪（B.1.621）、奥密克戎（B.1.1.529）等,这些突变毒株具有高传播力。由于这些突变毒株的RBD区域发生了突变,所以大部分国内外已报道的RBD中和抗体都对其失去了有效的保护作用。除此之外,随着突变毒株的出现,人们对于SARS-CoV-2抗体是否会介导抗体依赖性增强（antibody-dependent enhancement,ADE）效应的担忧逐渐加剧。前期研究,我们从新型冠状肺炎康复期患者外周血中获得数百株SARS-CoV-2 RBD特异性单克隆抗体。本研究拟对其中55A8抗体进行功能特性分析以及抗体依赖性感染增强效应研究。方法:将55A8抗体基因序列克隆到表达载体上,构建抗体质粒并转导到Expi293?细胞中表达抗体蛋白。利用Protein G亲和层析原理纯化55A8抗体;通过快速银染法验证抗体分子量。通过酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA）实验检测55A8抗体与SARS-CoV-2野生毒株和突变毒株S/S1重组蛋白的结合能力。通过表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance,SPR）实验测定55A8抗体亲和力。通过噬菌斑减少中和试验评估55A8抗体中和活病毒的能力。构建新冠假病毒,通过假病毒中和实验以评估55A8抗体中和假病毒的能力。将梯度稀释后55A8抗体与带有Luciferase报告基因的SARS-CoV-2野生型/突变型假病毒共孵育后感染Daudi/Raji/K562细胞,通过检测细胞内Luciferase的表达反映假病毒感染情况,以此分析抗体是否介导相应毒株产生ADE效应。通过使用anti-CD32抗体阻断Daudi细胞表面FcγRⅡ以验证ADE效应发生依赖于Ig G Fc段与靶细胞表面FcγRⅡ的相互作用。通过在55A8抗体Ig G Fc段引入LALA突变以消除抗体介导产生的ADE效应验证。结果:经蛋白表达和纯化后获得高纯度的55A8抗体。ELISA实验结果显示55A8抗体与SARS-CoV-2 S、B.1.1.7 S、B.1.351 S、B.1.1.529 S、P.1S1、D614G S1重组蛋白都表现出极强结合力,EC50值约在20 ng/m L左右;与B.1.617 S、B.1.617.2 S、C.37 S1重组蛋白表现出较强结合力,EC50值分别为82.13 ng/m L、64.17 ng/m L、89.28 ng/m L。SPR实验结果显示55A8抗体与SARS-CoV-2 S和B.1.1.529 S重组蛋白均表现出较强亲和力,亲和常数均小于1.0×10-12M。55A8抗体与B.1.617.2 S的亲和力相比稍弱,亲和常数等于2.58×10-9M。活病毒中和实验结果显示55A8抗体能有效中和SARS-CoV-2和B.1.351活病毒,其IC50分别为10.74 ng/m L和8.18 ng/m L。假病毒中和实验显示55A8抗体对SARS-CoV-2、B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.621、B.1.1.529假病毒具有强中和能力,IC50值均低于100 ng/m L,与这些毒株的相比,55A8抗体对B.1.617、B.1.617.2、C.37假病毒的中和能力稍弱。对比突变毒株上RBD突变点,我们发现55A8抗体对B.1.617、B.1.617.2、C.37假病毒中和能力较弱的原因可能与其出现RBD突变点L452R和L452Q有关。ADE效应分析实验发现55A8抗体介导4种主要的流行毒株包括B.1.1.7,B.1.351,B.1.617和B.1.617.2感染Daudi细胞增强,产生ADE效应,不介导野生毒株产生ADE效应。通过阻断实验封闭Daudi细胞表面FcγRⅡ,55A8抗体介导产生的ADE效应消失,证明ADE效应发生依赖于抗体Fc段与靶细胞表面FcγRⅡ的相互作用。进一步在55A8抗体Fc段引入LALA突变改造为55A8LALA抗体,ADE分析实验显示55A8LALA抗体不能介导新型冠状病毒突变流行毒株产生ADE效应。除此之外,55A8LALA与55A8抗体结合同种重组蛋白的EC50值相近,同样它们中和同种假病毒毒株的IC50值也显示差别较小,提示这种抗体改造方法不但可以消除抗体介导的ADE效应,且不影响其结合能力和中和能力。结论:1.55A8抗体与SARS-CoV-2野生毒株和流行突变毒株S/S1重组蛋白具有较强结合力和亲和力,且能有效中和SARS-CoV-2野生毒株和大部分流行突变毒株。2.55A8抗体能够介导SARS-CoV-2流行毒株B.1.1.7、B.1351、B.1.617、B.1.617.2产生ADE效应,不介导SARS-CoV-2野生毒株产生ADE效应,该ADE效应的产生依赖于抗体Fc段与靶细胞表面FcγRⅡ的相互作用。通过在55A8抗体Fc段引入LALA突变消除其介导新型冠状病毒突变毒株产生的ADE效应,且改造后抗体55A8LALA的结合能力与中和能力不受影响。