结直肠癌是全球常见的恶性肿瘤之一,严重危害人类健康。因此,筛选和鉴定新的结直肠癌相关基因、解析其作用机制,对改善结直肠癌患者的生存和预后有重要的现实意义。我们前期发现,B-Myb在结直肠癌组织中的表达明显升高,且其表达水平与结直肠癌淋巴结转移、癌症病理分期等密切相关。体内外实验证实,B-Myb能够促进结直肠癌细胞生长、细胞周期进程、细胞迁移侵袭和转移等。同时前期数据也提示,B-Myb和E2F2之间可能存在相互调控关系。本研究将在此基础上,综合多种分子生物学技术,对结直肠癌细胞中B-Myb与E2F2的相互调控关系进行深入和系统的分析。（1）E2F2基因启动子区域Myb和E2F结合位点的定点突变分析转录因子结合位点分析结果表明,E2F2启动子区域包含多个E2F和Myb的潜在结合位点。采用PCR技术构建了E2F2基因启动子荧光素酶报告基因重组载体（E2F2-P1314）,并采用基因定点突变技术构建了一系列的E2F和Myb结合位点的定点突变重组体。然后,将E2F2-P1314、各定点突变重组体分别与B-Myb、E2F2表达载体共转染细胞,采用双荧光素酶分析系统检测启动子活性。结果表明,单独转染B-Myb或E2F2可增强E2F2基因启动子活性,共转染B-Myb和E2F2可进一步增强E2F2基因启动子活性,但突变Myb和E2F结合位点后,B-Myb和E2F2对E2F2基因启动子的转录激活效应丧失。这些结果表明E2F2基因转录受B-Myb和E2F2自身的调节,并且依赖于E2F2基因启动子区域上的潜在的Myb和E2F结合位点。（2）B-Myb基因启动子区域Myb和E2F结合位点的定点突变分析我们进一步分析E2F2是否能调控B-Myb的转录激活。转录因子结合位点分析结果表明,B-Myb启动子区域存在多个E2F和Myb潜在结合位点。采用PCR技术构建了B-Myb基因启动子荧光素酶报告基因重组载体（B-Myb-P1064）,并以此为模板构建了一系列的E2F和Myb结合位点的定点突变重组体。采用双荧光素酶报告基因实验检测启动子活性。结果显示,单独转染E2F2或B-Myb能增强B-Myb基因启动子活性,共转染E2F2和B-Myb可进一步增强B-Myb基因启动子活性,而突变E2F和Myb结合位点后会明显削弱E2F2和B-Myb对B-Myb的转录激活效应。该部分结果强烈提示,B-Myb基因转录受E2F2和B-Myb自身的调节,并且依赖于B-Myb基因启动子区的E2F和Myb结合位点。（3）B-Myb和E2F2可通过E2F结合位点发挥转录激活效应我们进一步构建了3×E2F报告基因重组体以及相应的E2F结合位点的定点突变重组体。双荧光素酶分析实验结果表明,单独或共同转染B-Myb和E2F2都能显著激活3×E2F报告基因重组体的启动子活性,且依赖于该E2F结合位点。该结果进一步表明B-Myb和E2F2可以通过保守的E2F结合位点发挥转录激活效应。（4）B-Myb与E2F2相互作用的鉴定首先,通过间接免疫荧光实验探究B-Myb和E2F2在细胞内的定位情况,结果表明,B-Myb和E2F2共定位于结直肠癌细胞核内。随后,分子对接分析结果提示,B-Myb（26-184AA）与E2F2（123-197AA）存在潜在相互作用。进一步的邻位连接实验（PLA）结果表明,B-Myb和E2F2在细胞内存在近距离相互作用。免疫共沉淀实验结果也表明,B-Myb和E2F2在细胞内存在相互作用。我们试图通过GST Pull-down体外实验进一步证实二者的体外相互作用和相互作用结构域,但B-Myb和E2F2均无法在原核细胞内实现成功表达。因此,我们进一步构建了一系列的B-Myb和E2F2真核表达删除体,并进行免疫共沉淀实验,结果表明,B-Myb的N端结构域与E2F2存在较强的相互作用。综上,本研究发现,E2F2基因转录受B-Myb和E2F2自身的调节,B-Myb基因转录受E2F2和B-Myb自身的调节,说明B-Myb和E2F2可相互调节自身和对方的转录激活,从而形成了一个典型的前馈转录调控环。另外,B-Myb和E2F2还存在相互作用。B-Myb和E2F2前馈转录调控环的存在以及两者的相互作用,对于维持结直肠癌细胞内B-Myb和E2F2的高表达和结直肠癌细胞的恶性表型具有重要的生物学意义,是一个潜在的结直肠癌分子诊断和靶向治疗的潜在靶点。