大豆[Glycine Max（L.）Merr.]是世界上重要的油料作物和粮食作物,是食用油和蛋白质的主要来源之一。子叶是大豆种子胚的主要组成部分,其在种子萌发至幼苗的过程中起着重要作用。子叶在萌发后的生长状态直接影响植株整个生长周期的发育状态,从而进一步影响植株抗性、产量和品质等性状。前人通过构建子叶折叠突变体cco（curled-cotyledon）和大豆科丰1号杂交的F2代群体,采用SSR分子标记辅助选择定位到一个控制子叶折叠的位点,即5号染色体上的BARCSOYSSR050037和Satt684标记间。本研究在该定位区段内选择了 7个可能的候选基因,利用实时荧光定量的方法比较了这7个基因在“南农94-16”（WT）和cco中的表达情况。最终根据实时荧光定量结果并结合拟南芥同源基因注释选择了在种子中表达量相对较高且可能与植株生长发育相关的两个基因,即△1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶基因 GmP5CDH以及含有 DDT（DNA binding homeobox and different transcription factors）结构域的基因 GmDDT1。以 GmP5CDH 和GmDDT1 基因为研究对象,通过亚细胞定位、酵母双杂以及在拟南芥中异源过表达GmP5CDH和GmDDT1基因等一系列实验,初步研究GmP5CDH和GmDDT1基因的生物学功能,对了解它们对子叶折叠突变体生长发育的分子机制提供重要信息。突变体是植物遗传学研究、基因定位、克隆与功能研究的良好实验材料,也是很重要的功能基因组学研究材料。多重诱变的大规模CRISPR/Cas9筛选对于大豆遗传研究具有重要的价值。因此,本研究构建了一个大规模的种子特异表达基因的大豆CRISPR/Cas9突变体文库。主要研究结果如下:1、GmP5CDH是△1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶基因,含有Aldedh结构域。组织表达分析发现GmP5CDH在各个组织中均有表达,其中在开花后7天和13天种子中的表达相对较高。对大豆幼苗进行干旱、盐、冷害以及ABA等非生物胁迫处理,发现GmP5CDH基因表达受胁迫诱导。GmP5CDH蛋白主要定位在细胞膜和细胞核中。酵母双杂交筛选大豆叶和荚cDNA文库,发现有一个来源于叶文库的果糖二磷酸醛缩酶Glyma.04g008300和一个来自英文库的S-腺苷甲硫氨酸合酶Glyma.17g039100。拟南芥中异源表达GmP5CDH基因,结果表明过表达GmP5CDH显著降低了转基因拟南芥的萌发率,但总氨基酸含量显著提高。对转基因拟南芥进行盐和ABA处理后,发现根长和鲜重以及植株体内脯氨酸含量显著降低。相反,在外源Pro处理后,转基因株系的根长和鲜重以及脯氨酸含量显著提高,同时对种子萌发率的影响低于对照WT。2、GmDDT1是ISWI染色质重塑复合体组分中含DDT结构域的基因。组织表达分析发现GmDDT1基因在所有大豆组织中均有表达,但在开花后7天和13天种子中表达最高,在13天荚皮中表达最低。GmDDT1基因的表达水平受到干旱、盐、冷害以及ABA等非生物胁迫的诱导。亚细胞定位结果显示GmDDT1是一个核定位蛋白。利用酵母双杂交技术在大豆叶片和英文库中筛选与GmDDT1互作的蛋白,鉴定到两个来源于叶片文库,即ISWI染色质重塑复合物ATP酶Glyma15g10370、编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的基因Glyma08g47570和一个来源于荚文库的ISWI染色质重塑复合物ATP酶Glyma13g28720。在拟南芥中过表达GmDDT1基因,发现转基因拟南芥的表型与对照相比变化不大,但是转基因株系的氨基酸含量显著提高。3、本研究共设计1193个sgRNA来靶向481个在大豆种子中高度表达的基因。随机选取20个大肠杆菌单克隆进行Sanger测序发现sgRNA的准确性较高,达到95%。获得的农杆菌菌液可直接进行大豆转化,将为大豆功能基因组研究及遗传育种提供有价值的材料。