论文部分内容阅读
乳酸菌（Lactic acid bacteria,LAB）是一类可以利用发酵葡萄糖等碳水化合物,并产生大量乳酸的细菌的总称。乳酸菌通常被认为是安全的,越来越多的证据表明乳酸菌具有预防疾病和改善人类健康的生物活性。胞外多糖（exopolysaccharides,EPS）是乳酸菌等微生物在代谢过程中合成并分泌到环境中的粘液多糖以及粘附在菌体表面的荚膜多糖。据报道,大约有30种乳酸菌可以产生胞外多糖。胞外多糖具有多种潜在的生理功能和生物学活性,包括抗菌,降低胆固醇,抗氧化,抗肿瘤和免疫调节活性。胞外多糖的化学结构影响其生理功能,通常对EPS的单糖组成,分子量（Mw）,官能团和糖苷键模式等结构进行研究。大量研究表明,乳酸菌及其次生代谢产物胞外多糖在调节机体免疫、抗肿瘤和优化肠道微生态环境中发挥重要作用。因此,本课题在课题组前人研究的基础上,对来源于西藏灵菇（Tibetan kefir）的两株益生菌,瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）LZ-R-5 和戊糖乳杆菌（L.pentosus）LZ-R-17 发酵产生的胞外多糖的结构及其菌体表面特性进行分析。然后对L.helveticus LZ-R-5和L.pentosus LZ-R-17的体外免疫调节活性,体外抗肿瘤活性,及其肠道益生功能进行研究。主要结果如下:1.L.helveticus LZ-R-5 和L.pentosus LZ-R-1 7 胞外多糖结构研究实验测定了胞外多糖R-5-EPS、R-17-EPS的结构。扫描电子显微镜（SEM）观察表明R-5-EPS和R-17-EPS表观结构比较相似,表面光滑呈薄片状聚集,存在一些大小不一、不规则的空洞,多糖之间或以丝状或以片状连接,只是片段厚度、空洞数量、皱缩程度有些差异。R-5-EPS和R-17EPS的原子力显微镜（AFM）的结果表明,多糖表面形成道钉状的突起,R-5-EPS突起大小不一,小的高度为1.4nm,大的高度可达15.9nm,而R-17-EPS的突起大小比较均一,基本都在1-2 nm之间。通过差示扫描量热法（DSC）测定R-5-EPS熔点温度为187.22℃,R-17-EPS熔点温度为 160.97℃。Zeta电位分析,发现R-5-EPS 的 Zeta电势值为-121 mV,R-17-EPS的Zeta电势值为-110 mV,结果表明,较高的表面电荷引起较强的静电排斥,将有助于提高多糖在溶液中的稳定性。粒径分析也确定两种胞外多糖在溶液中有较高的稳定性。二维核磁共振分析表明,R-5-EPS由→3)-β-D-Glcp-（1→和→6）-β-D-Galp-(1→糖苷单元组成;R-17-EPS 由→4-β-D-Glcp-(1→和→2-β-D-Galp-(1→糖苷单元组成。2.L.helveticus LZ-R-5 和 L.pentosus LZ-R-17 菌体表面特性研究在无菌PBS缓冲液中,L.helveticus LZ-R-5活菌的Zeta电势绝对值为4.23 mV,而热灭活菌体的Zeta电势绝对值则更高为7.69 mV。L.pentosus LZ-R-17活菌比热灭活菌体的Zeta电势绝对值高。L.pentosus LZ-R-17活菌的疏水率比热灭活菌体的高,达到28.45%。而L.helveticus LZ-R-5的几乎不具备疏水性。另外,L.helveticus LZ-R-5和L.pentosus LZ-R-17都具有很好的自聚性。3.L.helveticus LZ-R-5 和 L.pentosus LZ-R-17 免疫调节活性采用体外细胞模型评价L.helveticus LZ-R-5和L.pentosus LZ-R-17的体外免疫活性。结果表明,R-5-EPS,R-17-EPS,L.helveticus LZ-R-5 和 L.pentosus LZ-R-17能有效促进小鼠腹腔巨噬细胞（RAW264.7）的增殖。用不同浓度的R-5-EPS 和 R-17-EPS 以及L.helveticus LZ-R-5 和L.pentosus LZ-R-17 处理 RAW264.7细胞,可显著提高细胞吞噬中性红的能力及其酸性磷酸酶活性（P＜0.05）。与空白对照相比,R-5-EPS,R-17-EPS（50-400 μg/mL）及两株Lactobacillus都能显著性提高细胞NO的释放量（P＜0.05）。最后,通过酶联免疫试剂盒测定样品处理后的细胞上清液,发现R-5-EPS,R-17-EPS,L.helveticus LZ-R-5和L.pentosus LZ-R-17能显著性提高细胞炎症因子TNF-α,IL-6,IL-1β和IL-10的释放量（P＜0.05）,表明L.helveticus LZ-R-5和L.LZ-R-17在体外具有较好的免疫促进作用。4.L.helveticus LZ-R-5和L.pentossu LZ-R-17 抗肿瘤活性利用体外肿瘤细胞模型进行研究发现,R-5-EPS,R-17-EPS,L.helveticus LZ-R-5和L.pentosus LZ-R-17对人胃癌细胞BGC-823的生长有一定的抑制作用。结果表明,R-5-EPS,R-17-EPS,L.helveticus LZ-R-5和L.pentosus LZ-R-17 作用BGC-823细胞后,细胞内的乳酸脱氢酶（LDH）活力显著升高。用Hoechst-33258试剂盒对细胞进行染色发现,细胞发生明显皱缩。此外,流式细胞仪分析发现,R-5-EPS,R-17-EPS,L.helveticus LZ-R-5 和 L.pentosus LZ-R-17 能显著提高BGC-823细胞的活性氧（ROS）水平,并对BGC-823细胞具有显著的凋亡诱导作用,总结发现,两株Lactobacillus（LZ-R-5,LZ-R-17）的作用效果比两种胞外多糖（R-5-EPS,R-17-EPS）的作用效果明显。AnnexinVFITC/PI双染法发现,R-5-EPS,R-17-EPS,L.helveticus LZ-R-5 和 L.pentosusLZ-R-17 通过将细胞周期阻滞在G2/M期来抑制BGC-823细胞的增殖。最后,利用酶联免疫试剂盒分析检测,发现L.helveticus LZ-R-5和L.pentosus LZ-R-17及其胞外多糖能使凋亡酶Caspase-3和Caspase-9的活性升高（P＜0.05）。5.L.helve ticusLZ-R-5和L.LZ-R-17对肠道微生物菌群的影响利用体外厌氧发酵方法对L.helveticus LZ-R-5和L.LZ-R-17的益生功能进行研究。结果表明,R-5-EPS,R-17-EPS,L.helveticus LZ-R-5和L.pentosus LZ-R-17能够降低发酵液的pH值,特别是活菌菌悬液使发酵体系的pH值显著下降。另外,R-5-EPS,R-17-EPS,L.helveticus LZ-R-5 和 L.pentosus LZ-R-17可以显著增加肠道微生物发酵体系中短链脂肪酸（SCFAs）的产生量（P＜0.05）,特别是乙酸、丙酸、丁酸等。同时,R-5-EPS,R-17-EPS,L.helveticus LZ-R-5和L.pentosus LZ-R-17能够调节肠道菌群结构,主要包括增加Megamonas、Bifidobacterium,Lactobacillaceae 和 Streptococcaceae 等有益菌的相对丰度,降低Escherichia.coli和Lachnospiraceae等有害菌的相对丰度。综合来看,L.helveticus LZ-R-5和L.pentosus LZ-R-17可以作为益生元发挥肠道菌群调节作用,影响某些肠道微生物,促进短链脂肪酸的产生等。