由于科学技术的进步,生产方式发生巨大变化,养殖者的养殖倾向完全转变,经济效益较高的品种更受欢迎,个别本土家畜甚至走向灭绝,比如阳坝牛、高台牛等。外来品种也不断冲击本土优良品种的数量,本土优良畜种岌岌可危,同时有些地方品种近亲繁育严重,会出现繁育困难、成活率低及优良基因难以延续等问题,精液冷冻技术的出现也大幅改良现有的繁育技术。为了更好地保护本土优良草食家畜品种,本试验基于人精液DNA试剂盒提取法,优化家畜冷冻精液DNA纯化方法,使用对畜种伤害最小的采样方式,如精液和毛发,并探讨冷冻精液中影响DNA提取质量的因素,以获得良好的DNA质量便于后续的测序分析。同时本研究以大通牦牛、德保矮马为主要研究对象,进行COI、CYTB、牛D-loop片段的遗传分析,主要有以下三部分:试验一、家畜冷冻精液DNA纯化的优化及影响因素分析为了得到良好的冷冻精液DNA纯化效果,本试验使用摩拉水牛冷冻精液,按100μL（或200 μL）样品初始量,以及0.5、1、1.5、2、3和5 h的蛋白酶解时间,使用人精液DNA试剂盒法纯化DNA。DNA产物从浓度、A260/A280和A260/A230三方面,结合琼脂糖凝胶电泳和PCR检测进行分析,最终确定DNA纯化的最佳精液初始量以及最佳蛋白质酶解时间。在此基础上,纯化67份来源于牛、马、驴等不同家畜品种的冷冻精液DNA,同时测定每份精液中蛋白质、甘油/甘油三酯和果糖的含量,结合精液样品的冻存时间,研究以上4种因素对DNA纯化质量的影响。结果显示:使用100μL冷冻精液,蛋白酶解3 h的纯化效果最好,而且酶解2和3 h的DNA产物,均可以满足后续核基因组和线粒体基因组常规PCR的要求。家畜冷冻精液中蛋白质、甘油/甘油三酯和果糖含量与提取DNA浓度、A260/A280和A260/A230纯度在不同程度上呈斯皮尔曼负相关,其中果糖是干扰DNA纯化的关键因素,同时样品的冻存时间与DNA质量存在显著正相关。虽然冷冻精液中蛋白质、甘油/甘油三酯和果糖的成分可以减轻冷冻复苏对精子的损伤,但这些成分的增加,会对DNA纯化质量产生一定的负面影响,即使它们随着冻存时间及DNA纯化时酶解时间的延长而有所消耗。试验二、大通牦牛、德保矮马线粒体基因的进化分析初步研究为对大通牦牛、德保矮马进行遗传进化分析,在上述试验的基础上,提取10头大通牦牛精液样本、8头德保矮马毛发样本的DNA,扩增其COI、CYTB和牛D-loop片段并进行测序,分析其遗传关系、G/C含量及系统发育树。结果表明:以上3种基因均扩增成功得到峰图良好的序列,长度均在引物设计的长度,这些基因的单倍型含量较高,多态性信息位点丰富,可以作为进化分析得到基因序列。这些线粒体基因的碱基A+T含量远大于G+C含量,A+T含量最低为德保矮马的CYTB基因53.9%,符合线粒体DNA的组成特点。基于牛COI、CYTB基因序列的NJ法系统进化树,能够较清晰明确区分试验物种,证明了其作为DNA条形码在大型草食家畜属水平鉴定的可行性。但马COI、CYTB基因及牛D-loop片段的进化树不能清晰聚类各物种,在马种级别的鉴定上还存在一定的交叉问题,该方法还需结合形态学数据或将更多的线粒体基因序列信息联用。总之,本试验优化后的人精液DNA试剂盒法可完全适用于家畜冷冻精液DNA的纯化,明确了影响精液DNA纯化的影响因素,进一步证明了线粒体基因COI、CYTB基因在分析牛亚科草食家畜中的可行性。