基于转录组学和代谢组学银杏酸生物合成关键基因筛选与表达

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银杏酸属漆酸类,是银杏特有的植保素,能够用于植物源农药和医药开发。已有研究表明,脂酰CoA合成酶(Ketoacyl CoA Synthase,KCS)和脂酰-酰基载体蛋白去饱和酶(Acyl-ACPDesaturase,AAD)能分别决定漆酸的含量和成分比例。本研究利用银杏种实(外种皮与种仁)的转录组测序和HPLC-MS/MS代谢物测定数据,分析了种实发育代谢途径特征,鉴定出银杏酸及其合成前体,筛选到银杏酸合成关键基因,对关键基因进行克隆、表达与生物信息分析。主要研究结果如下:1、银杏种实发育代谢途径特征对种实(外种皮和种仁)的HPLC-MS/MS代谢物进行测定,发现糖、核酸、氨基酸、辅酶因子和维生素及脂肪代谢物作为营养元素参与植物的生长发育过程。而次生代谢产物、能量代谢产物、其他类氨基酸和萜烯类和多酮类代谢物也有显著变化。对测定数据进行筛选,检测到54种苯环型物质(Benzenoids)和175种脂类和类脂类物质(Lipids and lipid-like molecules),通过KEGG通路的富集分析,获得3种银杏酸(氢化白果酸(C15:0)、白果酸(C15:1)和十七烷一烯基银杏酸(C17:1)和4种前体脂类(棕榈酰胺、棕榈油酸、硬脂酰胺和油酸酰胺),它们在外种皮的含量高于种仁,含量趋势分析表明棕榈油酸与3种银杏酸之间有显著相关性,是重要的候选前体物质。2、差异表达基因的筛选对发育种实(外种皮和种仁)的转录组测序数据进行差异表达基因的KEGG富集,筛选富集于脂肪酸合成、脂肪酸延长和植物病原互作通路的关键基因,得到具有表达差异的10个KCS家族基因、2个AAD家族基因和9个MYB家族基因。21个基因在外种皮中有4种表达趋势,其中基因Gb 20097(KCS同源基因)和Gb33428(AAD同源基因)随着发育成熟表达量持续增高。3、关键基因的筛选与表达验证对银杏酸及前体物质和21个差异表达基因进行相关性分析发现,基因Gb20097和Gb33428具有独特的表达模式,它们的表达趋势与两种银杏酸(白果酸和氢化白果酸)含量的变化趋势一致。利用qRT-PCR检测2个基因的表达量,HPLC检测银杏酸含量和积累量,将表达量数据与含量和积累量数据共分析,结果表明基因Gb20097和Gb33428的表达模式与银杏酸积累趋势显著性正相关,认定2个基因为银杏酸合成调控的关键基因。4、关键基因的生物信息学分析通过氨基酸序列比对和进化同源分析等发现,Gb20097是FAE1型酮酯酰CoA合成酶,属于Ⅲ型聚酮合成酶家族(PKSⅢ),其具有保守Cys-His-Asn的3联催化活性位点,保证能与酰基底物及丙二酰-CoA相结合,催化丙二酰-CoA脱羧完成聚酮延长反应;而Gb33428是银杏R2R3MYB14转录因子,属R2R3-MYB家族,能受到多种激素的调控,与调控脂肪酸延长的AtMYB30转录因子同源性高。本研究成功克隆了Gb 20097基因并构建A-T载体,以便进一步的基因功能研究。
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