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目的:以TCF转录子为靶点筛选具有Wnt通路抑制活性的化合物,并开展其作用机制研究。方法:将TCF转录子Bindingsite克隆到带荧光素酶基因的表达载体,转染到293T工具细胞中,24h后接种到96孔板中同时加入10%的Wnt3A细胞上清液,12h后加入化合物,以DMSO组为空白对照。药物作用12h后离心去掉细胞液,加入荧光素酶裂解液,置于酶标仪中读取数据,每个样本重复3次。将乳腺癌细胞MDA-MB231,白血病细胞K562、HEL,黑色素瘤细胞WM9,胰腺癌细胞SW480等,接种于96孔板中,每孔约8000个细胞,加入活性化合物,72h后离心去掉细胞液,加入MTT液作用4h,离心去掉MTT液,每孔加入200μlDMSO,水平摇床摇晃至完全溶解,酶标仪下490nm处检测。将乳腺癌MDA-MB231细胞接种于6孔板中,加入具有细胞毒性化合物作用24h,按照试剂盒说明书操作,流式细胞仪下检测周期凋亡。将乳腺癌细胞MDA-MB231接种于6孔板中,加入具有细胞毒性化合物作用24h,提取RNA,照试剂盒说明书PCR仪中检测相关基因表达量,同上所述接种细胞,加入活性化合物作用12h,Western blot检测相关蛋白表达。结果:荧光素酶化合筛选系统筛选了1500余个化合物,其中2个化合物A661、A665能够抑制转录子TCFBS基因表达,提示A661、A665能够抑制Wnt通路;经细胞毒性实验(MTT法)检测发现,这两个化合物对乳腺癌细胞MDAMB231,白血病细胞K562、HEL,黑色素瘤细胞WM9及结肠癌细胞SW480有较强的细胞毒性,通过流式细胞仪检测发现A661能够明显引起乳腺癌细胞MDA-MB231发生凋亡,A665能够引起白血病细胞K562发生凋亡,A661及A665能够引起白血病细胞HEL发生凋亡,A661及A665能够引起乳腺癌细胞MDA-MB231 S/G2期阻滞;进一步的机理研究发现A661及A665能够在MDAMB231中抑制Wnt通路靶蛋白β-catenin、cyclin D1的表达,抑制Wnt通路靶基因Axin2的mRNA表达,并激活GSK3蛋白的磷酸化,磷酸化的GSK3能够降解Wnt通路靶蛋白β-catenin表达,从而阻滞Wnt通路;体内实验结果显示化合物A661及A665能够延长Friend病毒引起的白血病小鼠存活时间,增加血红细胞数量,改善贫血症状;研究还发现:A661及A665为Fli-1的抑制剂,能够抑制红白血病关键调控因子Fli-1表达,促进Fli-1下游负调控靶基因的表达。结论:通过本项研究证实:化合物A661及A665对多种肿瘤细胞具有细胞毒性,能够引起肿瘤细胞发生细胞凋亡及细胞周期阻滞,通过抑制Wnt通路相关靶蛋白及靶基因的表达抑制Wnt通路,能够抑制Fli-1表达;小鼠体内试验结果表明化合物能够显著延长白血病模型小鼠存活时间,为进一步的临床应用提供了重要的科学依据。