目的：　　酸敏感离子通道1a(ASIC1a)是胞外H+激活的阳离子通道家族的成员。课题组前期表明ASIC1a参与酸诱导的大鼠关节软骨细胞的自噬。然而，其潜在机制仍不清楚。本研究证实了ASIC1a对大鼠关节软骨细胞的自噬的作用，并探讨了其可能的分子机制。　　方法：　　1.胞外酸化不同pH（pH 7.0、pH 6.5、pH 6.0、pH 5.5）处理大鼠关节软骨细胞3小时及在不同时间点（1、3、6、12或24 h）酸化处理软骨细胞（pH 6.0）。然后，利用Western blot法检测Beclin1、LC3B-Ⅱ蛋白表达；qRT-PCR法检测LC3、Beclin1和ATG5 mRNA的表达。结果表明胞外酸化刺激可诱导大鼠关节软骨细胞的自噬。　　2.胞外酸化（pH 6.0）在不同时间点刺激大鼠关节软骨细胞，利用Western blot检测ASIC1a的表达水平，同时利用免疫荧光法来评估和定位ASIC1a的表达。利用激光共聚焦显微镜检测各种条件下胞内Ca2+浓度的变化。同时，在应用ASIC1a特异性阻断剂PcTx1和钙离子螯合剂BAPTA-AM之后，检测酸诱导的自噬相关基因和蛋白的表达情况。Monodansylcadaverine（MDC）荧光染色法检测自噬囊泡的形成情况。　　3.酸处理（pH 6.0）大鼠关节软骨细胞不同时间，Western blot检测FoxO3a蛋白表达。同时，提取核蛋白分析核内FoxO3a的表达，免疫荧光法进一步检测FoxO3a的胞内定位表达。应用ASIC1a特异性阻断剂PcTx1和钙螯合剂BAPTA-AM预处理，Western blot检测酸诱导的FoxO3a蛋白的表达情况。为进一步确定FoxO3a的功能，利用siRNA沉默处理大鼠关节软骨细胞，再利用qRT-PCR和Westernblot分析自噬相关基因和蛋白的表达。此外，mcherry-EGFP-LC3B质粒转染，检测沉默FoxO3a之后自噬小体的数目变化情况，后通过透射电镜进一步观察软骨细胞的超微结构变化。　　4.酸处理（pH 6.0）大鼠关节软骨细胞不同时间，Western blot检测AMPKα的磷酸化水平。预处理ASIC1a特异性阻断剂PcTx1和钙螯合剂BAPTA-AM后，Western blot检测AMPK的磷酸化情况。然后，转染AMPKα siRNA，利用Western blot分析确定下游FoxO3a的表达水平及自噬相关蛋白的表达。进一步应用AMPK抑制剂，复合物C（Compound C）预处理，qRT-PCR和Western blot法检测FoxO3a和自噬相关基因及蛋白的表达。此外，通过转染EGFP-LC3质粒，观察荧光点聚集情况变化。　　结果：　　1.胞外酸化诱导了大鼠关节软骨细胞的自噬　　Western blot结果显示，LC3B-II和Beclin1蛋白在pH 6.0处理3 h后蛋白表达显著增加。qRT-PCR分析也表明，关节软骨细胞LC3，Beclin1和ATG5 mRNA的表达在3 h时最为明显。　　2.ASIC1a促进大鼠关节软骨细胞酸诱导的自噬，且与[Ca2+]i增加有关　　酸处理可增加大鼠关节软骨细胞ASIC1a的蛋白表达。在关节软骨细胞的质膜中观察到ASIC1a的免疫荧光细胞染色，并且其在酸处理的细胞中表达增加。激光共聚焦结果表明酸化刺激（pH 6.0）使胞内的钙离子显著增加。而在应用ASIC1a特异性阻断剂PcTx1和钙螯合剂BAPTA-AM预处理后，可显著降低酸刺激时细胞内钙的浓度。用ASIC1a特异性阻断剂PcTx1和钙螯合剂BAPTA-AM预处理可明显抑制自噬相关蛋白LC3B-II，Beclin1的表达。单丹磺酰尸胺（MDC）染色显示，与对照组相比，酸处理3小时的细胞在细胞质中显示出相当大量的自噬泡，然而，在用抑制剂预处理的关节软骨细胞中自噬泡数目明显减少。以上结果表明，活化的ASIC1a促进大鼠关节软骨细胞的自噬，这与课题组前期的研究相一致。　　3.转录因子FoxO3a在ASIC1a介导的大鼠关节软骨细胞的自噬中发挥关键作用　　胞外酸化（pH 6.0）刺激可增加FoxO3a的表达，并且使其核内表达水平增加约两倍，同时免疫荧光结果显示，酸处理可使大鼠关节软骨细胞内FoxO3a表达增加。然而，用ASIC1a特异性阻断剂PcTx1和钙螯合剂BAPTA-AM预处理可减少酸诱导的胞内FoxO3a的蛋白表达。用siRNA沉默FoxO3a可显著降低酸诱导的LC3B-II，Beclin1和ATG5基因和蛋白的表达。在用mCherry-EGFP-LC3B质粒瞬时转染大鼠关节软骨细胞后，与对照相比，酸处理明显提高了自噬溶酶体数目，然而敲除FoxO3a基因减少了酸诱导形成的自噬小体。透射电镜结果亦是如此。这些表明ASIC1a促进了FoxO3a的激活，并且FoxO3a信号的激活在ASIC1a介导的大鼠关节软骨细胞的自噬中的发挥关键作用。　　4.AMPK/FoxO3a信号通路参与了ASIC1a介导的大鼠关节软骨细胞的自噬　　胞外酸化（pH 6.0）处理软骨细胞可使AMPK快速磷酸化，并且用ASIC1a特异性阻断剂PcTx1和钙螯合剂BAPTA-AM预处理可以降低酸诱导的AMPK的磷酸化水平。此外，沉默AMPKα可降低酸诱导的FoxO3a的表达及自噬相关蛋白的表达。AMPK的药理学抑制剂复合物C预处理显示相类似的结果，即复合物C可抑制酸诱导的总FoxO3a和核FoxO3a的表达。此外，复合物C还显著降低酸诱导的关节软骨细胞中LC3B-II和Beclin1的mRNA和蛋白的表达以及GFP-LC3荧光点聚集阳性细胞的数量。以上结果表明ASIC1a促进了酸诱导的AMPK/FoxO3a轴的活化，且其在调节ASIC1a介导的关节软骨细胞的自噬过程中发挥了重要作用。　　结论：　　1.ASIC1a的激活促进了酸诱导的大鼠关节软骨细胞的自噬，并且由AMPK/FoxO3a信号通路介导。　　2.酸处理的关节软骨细胞中，ASIC1a介导的胞内钙离子的增加作为一种上游信号激活了AMPK和FoxO3a。　　3.AMPK/FoxO3a信号通路的研究，将使我们对ASIC1a的功能有更加全面的认识，为针对RA关节软骨细胞损伤提供一种新的治疗策略。