论文部分内容阅读
核酸滚环扩增(Rolling Circle Amplification,RCA)即人为模拟自然界中病原微生物环状DNA分子滚环复制方式而建立的一种体外核酸恒温扩增方法,该方法一经建立便以其反应条件简单、扩增高效的特点在生命科学研究的各个领域引起了极大的关注。传统的滚环扩增方法体系中主要包括以下三个要素:环状DNA模板、单链DNA引物和适量的DNA聚合酶。反应中单链DNA引物在DNA聚合酶的催化下,沿着环状DNA模板由5’端向3’端方向合成一段含有若干个重复序列的线状单链DNA产物,这即是第一代核酸扩增技术,也被称作线性滚环扩增技术(LRCA)。随着核酸扩增技术的不断发展,以RCA技术为基础衍生出的新一代滚环扩增技术也日益多元化,如后续发展出的超分支滚环扩增(Hyperbranched Rolling Circle Amplification,HRCA)、网状滚环扩增(Netlike Rolling Circle Amplification,NRCA)等。本工作中,我们在深入研究传统RCA技术的基础上,着眼于将RCA技术与纳米材料或一些其它核酸技术相结合,研究新型滚环扩增技术,并就其在核酸分析领域的应用价值进行探讨,最终提出了两种新型的滚环扩增技术的应用途径:一是微小RNA的单核苷酸多态性分析,另一是DNA断裂事件的分析。实验结果表明,上述两种新型RCA技术均具有高度的应用潜能以及进一步发展的价值,为RCA技术在核酸分析领域的拓展应用提供了两个独具特色的潜在方向。1.还原石墨烯辅助的核酸滚环扩增技术用于微小RNA的单核苷酸多态性的检测研究由于一种微小RNA(mi RNA)往往调控上百个基因的表达,因此其单碱基的突变将引起广泛的病理反应。对mi RNA的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNPs)进行分析具有重要的医学价值。在本章中,我们提出了一种新型核酸滚环扩增技术,即还原石墨烯辅助的核酸滚环扩增技术(Reduced Graphene Oxide assisted Rolling Circle Amplification,r GO-RCA),该技术在传统滚环扩增技术的基础上,引入了还原石墨烯作为辅助,使滚环扩增的特异性大幅提升。以该方法优良的特异性为突破口,我们将其应用到了mi RNA的SNPs的检测中。本研究首先采用传统的琼脂糖凝胶电泳对实验条件进行了优化,接着采用傅里叶红外光谱(FITR)等手段对r GO的作用原理进行了探讨,并利用原子力显微镜(AFM)对扩增产物进行了直观的表征研究,最后应用荧光定量PCR以及荧光光谱进行了mi RNA SNPs的定量研究。结果表明,在mi RNA SNPs检测中,该方法对单个SNP的检测区分度可高达100倍,大大超出了一些现有的SNP检测手段。以mi R-125a和let-7a为例,我们成功检测了这两种mi RNA的SNPs。此外,除了极高的特异性外,本方法的灵敏度及重复性也被证明非常适于mi RNA实际检测的要求。因此,该方法将有望作为临床mi RNA SNPs检测的潜在方案,其应用前景非常广阔。2.末端封闭的核酸滚环扩增技术用于DNA断裂事件的检测研究DNA的断裂是DNA损伤的最为重要的形式之一,对DNA的断裂事件进行灵敏的检测分析是研究DNA断裂机制以及相关诱导因素的前提条件。在本章中,我们通过将传统的核酸滚环扩增技术与引物末端封闭技术有机结合,提出了一种新型的滚环扩增技术,即末端封闭的核酸滚环扩增技术(Terminal Blocked Rolling Circle Amplification,TB-RCA),并将该方法用于DNA断裂事件的检测。该方法的核心是在传统RCA的基础上引入一段有末端封闭序列的引物,在无DNA断裂事件发生时,引物处于完整状态,末端封闭序列的存在使滚环扩增反应被抑制。反之,当DNA断裂事件发生时,引物被切割成随机片段,末端封闭序列随之分离,RCA反应解除抑制后正常扩增。通过该方法我们可以灵敏的检测DNA断裂事件的发生。本研究首先采用传统的琼脂糖凝胶电泳手段对各反应条件进行了优化,而后利用荧光光谱对断裂事件进行定量分析。以Fenton反应以及切刻内切酶诱发的DNA断裂事件为例,我们对实际DNA断裂事件进行了模拟检测。结果表明,本技术可以灵敏地检测DNA断裂事件的发生。与现有的多数DNA断裂事件检测方法相比,本方法操作上更简便,灵敏度较高,并且适用于检测多种类型的断裂事件。该技术为DNA断裂事件的体外筛查提供了一种非常有吸引力的潜在方案。