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核酸诊断在疾病诊断和治疗中具有重要意义,现有的分子生物学检测技术通常需要精密仪器和专业人员操作,但是在一些边远地区或贫困地区,往往缺乏资金和设备,因此亟待开发出低廉简便的核酸检测产品。本论文中,我们建立了基于滚环扩增(RCA)和磁珠聚集显色的目视法核酸检测方法(RCA-MPA)。首先设计了具有高度靶向特异性的锁式探针,通过对基因组DNA进行酶切处理得到单链靶向分子,然后进行靶向识别和探针连接,最后进行RCA反应和磁珠聚集显色。磁珠与长链DNA之间通过物理性吸附作用相互缠绕,被磁铁聚集成不易分散的团聚物,短链DNA (<1kb)则无此功能,因此基于此原理可以对溶液中的扩增产物实现肉眼检测。本论文以生殖器人乳头瘤病毒-18(HPV-18) E7基因上的一段序列,作为模型样品,进行RCA-MPA的可行性实验。成功实现靶向特异性测定,检测限为0.62amol (124fM)。此外,还在HeLa细胞内以及添加了靶向分子的血液样品中测到了HPV-18E7基因,初步证明该方法可以用于实际样品分析。RCA-MPA法具有高特异性、高灵敏度和低成本等特点,有望用于现场诊断。第一章绪论部分介绍了以聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)和RCA为代表的核酸扩增技术的原理、方法和应用,并重点综述了RCA技术的发展、种类、特点以及检测方法和应用。最后介绍了几种适用于现场检测的技术,如芯片实验室、试纸条生物传感器和基于纳米粒子的比色法核酸检测技术等。第二章是L-RCA核酸检测方法的构建。建立了一套以DNA为靶向分子的均相基于连接滚环扩增(L-RCA)扩增体系,通过凝胶电泳考察连接反应和RCA反应的效果,使用外切酶酶切处理的方法,验证连接产物中是否存在环状DNA分子,并且改进连接条件,提高了padlock成环的概率。此外,对比了单引物RCA和双引物RCA的扩增效率和背景干扰程度。最终证实单引物RCA具有更强的区分信号和背景的能力,在现场检测方面拥有巨大的潜能。第三章为HPV-18基因检测。在本工作中,建立了一套基于L-RCA反应和磁珠聚集显色的目视法核酸检测体系。连接反应中以Taq DNA连接酶替代T4DNA连接酶,减少非特异性连接产生的背景信号,提高检测特异性。以磁珠聚集显色方法替代常规的荧光标记方法,实现目视法检测HPV-18病毒E7基因,最低检测限为0.62amol,与常规的肉眼检测方法相比,灵敏度提高了1000倍。该方法被成功用于体外培养的细胞系(HeLa和Huh-7)和添加了靶向分子的血液样品中HPV-18基因的检测,证明具有检测实际样品的能力。综上所述,通过本论文的研究工作,我们提出了一种基于滚环扩增和磁珠聚集显色的核酸检测技术。不同于以往基于微型化系统的芯片技术,RCA-MPA方法通过等温扩增和聚集显色来实现核酸检测,不需要传统的循环控温系统和荧光检测设备,从方法学方面简化了系统。整个检测过程只需要移液器、恒温设备(水浴锅)和相机(手机)即可完成。不仅大大降低了检测成本,而且使得该技术不受环境和基础设施的限制,可以用于边远地区以及经济不发达地区的基层医疗卫生防疫部门,作为病原体检测和基因相关疾病筛选的工具,具有广阔的发展空间和应用前景。