本论文分为两个部分，共六章，第一部分主要工作为染色体大片段的遗传操作，其中包括三章，第一章为应用Cre-LoxP系统在细胞内原位套取染色体大片段；第二章为用TAR((transformation-associaterecombination)建立hIGH基因YAC文库；第三章为文献综述；第二部分主要讨论siRNA作用靶点的筛选和shRNA的转录调控，也分为三章，第四章为体外无细胞系统快速有效地筛选siRNA位点；第五章为可调控的shRNA的转录；第六章为文献综述. 第一章：细胞内原位直接定点切割和扩增特定基因大片段，可以获得需要的基因簇。我们利用Cre-LoxP系统，分别将两个LoxP位点定点整合到免疫球蛋白重链基因两侧，再经Cre酶作用，经药物筛选得到具有环状YAC的细胞克隆。经Southernblot和FISH等鉴定，这一环状结构可以稳定的在细胞中存在。用此项技术能直接获得特定基因大片段，可以用于定点克隆基因大片段，基因治疗和基因功能等研究上。 第二章：酵母具有较高的同源重组效率，我们在转染酵母时，hIgH基因C区和V区两个同源臂，与人胚胎肝细胞基因组DNA共转染，在酵母内同源重组后，hIgH基因片断从人细胞基因组中直接克隆出来，形成一个YAC库。经PCR检测，该库中的YAC克隆涵盖了hIgH基因C，J，D，V四个区。此法避免了在体外克隆大片段时的烦琐，冗长，费时的筛选，酶切，连接过程。 第三章：概述了基因靶位操作的原理和策略；对近年来在同源重组技术上的进展做了简要介绍，着重讲述了哺乳动物细胞的同源重组和筛选策略。 第四章：本章描述了一种体外用无细胞系统进行PNA干扰的方法，干扰结果经由Northernblot确定，其结果和Westernblot，和我们在镜下观察到的干扰结果一致，这样可以很方便的在体外快速的确定RNA干扰作用的位点，比目前现有的确定RNA干扰的位点的方法都简洁快速。 第五章：由RNA聚合酶Ⅱ启动的shRNA转录是目前调控shRNA的一个趋势；本章研究了一种经过简约改造的腺病毒启动子E1b,该启动子是一个RNA聚合酶Ⅱ启动子，经过改造，只剩下49bp，包括TATAbox和转录起点这些必要元素。在这个最简化的E1b启动子基础上构建的shRNA表达系统在整合到宿主基因组后可以引起长期的RNA干扰效应。而且当激活蛋白Gal4-VP16的表达受Dexamethasone调控时，相应的RNA干扰效应也具有可诱导调控的特性。 第六章：简单概述了近年来RNA干扰的机制的研究动向及其在疾病治疗中的应用。