花生营养丰富,是一种常见食品,但也是一种常见的食物过敏原。近年来,花生过敏的患病率一直在上升,虽然研究表明免疫疗法可以减轻过敏个体对花生的反应,或者在儿童时期逐渐摄入含有微量花生蛋白的食物可以提高他们对花生和花生制品的耐受性,但这些方法尚未达到临床治疗水平,预防过敏反应的主流方法是避免接触花生过敏原。因此,开发一种快速、方便、准确的方法来检测加工食品中残留的花生致敏蛋白是非常必要和迫切的。花生球蛋白是主要的花生过敏原之一,同时也被WHO/IUIS命名为Ara h 3。本研究以花生球蛋白为研究对象,在制备免疫学特性良好的兔源pAb和鼠源m Ab的基础上,建立花生球蛋白的双抗夹心ELISA检测方法。研究结果如下:提取并纯化花生球蛋白,电泳鉴定纯度达80%以上,然后以此为免疫原免疫4只新西兰大白兔,四次免疫后心脏取血并分离纯化血清,测定其免疫学特性。结果表明,4只兔子的效价均达到了1:1.28×10~4,半数抑制浓度(IC50)分别为583、280、262和478 ng/m L。对效价较好的1号兔子的血清进行纯化,效价提高到了1:5.12×10~4,半数抑制浓度为246 ng/m L,敏感性最好。选取1号兔子纯化前后的血清进行特异性鉴定,纯化前血清与其他致敏蛋白的交叉反应率均小于0.6%,纯化后血清与其他致敏蛋白的交叉反应率均小于0.3%,因此,选用1号兔子纯化后的血清进行后续试验。将花生球蛋白免疫5只6～8周龄的Balb/c小鼠,四免一周后断尾取血,测定其免疫学特性。结果表明,5只小鼠的效价均达到了1:5.12×10~4以上,其中2号小鼠的敏感性最好,半数抑制浓度为320 ng/m L,且与伴花生球蛋白、大豆蛋白、牛血清白蛋白、麦朊蛋白、乳清蛋白的交叉反应率均小于0.5%。Western blot结果显示,花生球蛋白亚基处产生了可以被清晰识别的条带,表明成功制备出了花生球蛋白鼠源多抗血清。选择免疫效果最好的2号小鼠进行细胞融合试验,经过两次克隆和筛选,获得3株稳定分泌花生球蛋白m Ab的细胞株,分别命名为2E1、4B2、4H4,并通过小鼠体内诱生腹水法进行大量制备。腹水效价分别为1:1.28×10~5、1:5.12×10~5和1:5.12×10~5,纯化后效价分别为1:2.56×10~5、1:5.12×10~5和1:5.12×10~5,其中4B2 m Ab的整体效果较好,因此选用纯化后的4B2 m Ab进行后续试验,其纯化后浓度为4.248 mg/m L,IC50为356 ng/m L,亲和常数Ka为5.9×10~7 L/mol,交叉反应试验表明纯化的4B2 m Ab具有很强的特异性。基于制备的兔源pAb和鼠源mAb,利用双抗夹心模式建立了花生球蛋白的ELISA检测方法。优化各反应条件后组装ELISA检测试剂盒,该试剂盒的检测限为12.9ng/m L,线性范围为9.77～5000 ng/m L,平均添加回收率为86.08%～92.25%,变异系数小于15%,与其他致敏蛋白无交叉反应,稳定性较好且能用于真实食品的检测。