纤维素酶是一种复合酶,分解纤维素时起生物催化作用,广泛存在于自然界的生物体内。一般用于生产纤维素酶的菌株主要为丝状真菌,产生外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和p一葡萄糖苷酶,三种酶结合正调控和负调控的双重机制调控多种基因的转录和编码。纤维素酶基因的表达受到碳源的影响,其中葡萄糖可抑制这些基因的表达。CRE蛋白是在丝状真菌中普遍存在的一种碳源代谢抑制因子。目前,解除纤维素酶表达过程中的碳源阻遏效应,提高纤维素酶基因的表达己成为研究的重要趋势。本实验室从黄山生态林中采集并分离出一株高产纤维素酶的匍枝根霉TP-02,以其为出发菌株进行研究。从基因组中扩增得到碳代谢阻遏基因并对其进行生物信息学分析,将潮霉素B基因插入其中,转化获得CRE缺失菌株,并对纤维素酶基因转录调控特性展开研究。主要研究内容包括：(1)根据已经公布的基因序列,设计简并引物,以匍枝根霉TP-02染色体为模板进行扩增,获得1284bp的序列。将克隆得到的基因序列提交NCBI进行核酸比对,比对发现cre基因编码区长1284bp,编码428个氨基酸。与曲霉属cre基因具有较高的同源性。(2)以pRS303H质粒为模板,克隆得到潮霉素B抗性基因hygB片段。根据生物信息学软件分析hygB与cre基因的整合位点并设计引物,克隆了cre上下游同源区序列,潮霉素为筛选标记。利用重叠PCR技术构建融合基因cre-HygB,全长2310bp,并转化匍枝根霉萌发孢子,在潮霉素抗性平板上筛选获得阳性克隆。将筛选获得的分生孢子传代于含有潮霉素的平板,挑选传代10代以上的菌株。(3)提取转化子染色体DNA,利用hygB两段引物扩增抗性基因,验证所筛菌株带有潮霉素抗性基因；利用cre同源区上下游引物扩增全长,目的条带单一,大小一致。PCR验证结果显示,ΔCRE菌株构建成功。进一步验证ΔCRE菌株中外源片段发生同源重组时在染色体中的拷贝数,提取筛选到的5株转化子的总RNA。利用反转录试剂盒合成cDNA单链,以SYBR为荧光染料进行RT-PCR分析。结果显示,有一株未检测到原始菌株cre基因的拷贝数,同源重组成功,获得ΔCRE菌株。(4)为了分析匍枝根霉中cre基因的功能,通过发酵实验对TP-02原始菌株和ACRE突变株进行比较。选取不同浓度碳源进行发酵,2%葡萄糖浓度下,ΔCRE突变株的滤纸酶活相比较匍枝根霉TP-02提高了33%；3%葡萄糖浓度下,突变株的滤纸酶活相较匍枝根霉TP-02提高了21.8%。随着糖浓度的增加,酶活的高峰期出现了滞后现象,表明cre基因的破坏明显削弱了CRE因子对纤维素酶表达的抑制作用。利用RT-PCR对此突变株纤维素酶基因转录水平进行研究,发现eg, bg, cbh1和cbh2的转录均有所提高,分别为48.75%,26%,5.6%和38.6%。匍枝根霉利用葡萄糖产纤维素酶的过程中,三种主要的酶类的合成代谢与糖类物质息息相关。CRE的敲除使得纤维素酶相关基因表达上调,具有调控特异性。培养过程中不同浓度的糖会影响关键酶的产生。菌体中碳代谢阻遏因子CRE的破坏解除其对纤维素酶转录调控的抑制,削弱了纤维素酶生产的碳代谢阻遏效应,使得纤维素酶基因高效表达,提高了纤维素酶的产量,为产业化生产提供了有利保障。