论文部分内容阅读
目的:1.探究S1P及其受体在狼疮肾炎中的表达情况2.探究S1P/S1PR1信号通路在狼疮肾炎中发挥的作用3.探究S1P/S1PR1信号通路在调控肾脏炎症中的可能机制4.探究S1P/S1PR1信号通路在调控M1型巨噬细胞极化中的可能机制方法:第一部分S1P/S1PR1信号通路在MRL/lpr小鼠体内表达情况及调控肾脏炎症的机制研究1.选用6~8周龄雌性自发性红斑狼疮MRL/lpr小鼠,随机分为生理盐水处理的模型组以及FTY720治疗组,相同周龄的雌性BALB/c野生型小鼠做为正常对照。饲养过程中每周对小鼠进行尿蛋白检测,在出现尿蛋白升高时进行灌胃给药。在小鼠10周龄时开始干预,FTY720的给药浓度为2mg/kg,每周给药三次,持续12周,给药过程中每两周对小鼠进行一次尿蛋白检测。2.给药周期结束后,留取小鼠血清检测抗ds-DNA抗体,S1P浓度以及肌酐,尿素氮;留取脾脏测量大小及重量,拍照;肾组织取部分制成组织匀浆用于检测S1P浓度,部分包埋切片进行免疫荧光染色,病理染色,免疫组织化学染色以及透射电镜观察,部分提取总蛋白和RNA,用于western blot和Real-time PCR实验。3.Real-time PCR检测肾脏极化巨噬细胞标志物(M1型:CD86,i NOS,M2型:CD206,Arg1)以及炎症因子IL-6,TNF-α,IL-1β,IL-18的表达水平;western blot检测肾脏NLRP3炎症小体表达水平;免疫荧光染色检测肾脏F4/80+CD86+的M1型巨噬细胞比例;免疫组织化学染色检测肾脏F4/80+巨噬细胞浸润,S1PR1和NLRP3表达水平。第二部分体外研究S1P/S1PR1在M1型巨噬细胞极化中的调控机制1.培养小鼠RAW264.7巨噬细胞株,S1P(1μmol/L)刺激,Real-time PCR检测极化巨噬细胞标志物(M1型:CD86,i NOS,M2型:CD206,Arg1)表达水平;流式细胞术对RAW264.7分型,检测CD86+M1和CD206+M2型细胞比例。2.Real-time PCR和western blot检测RAW264.7表面S1P受体表达情况,转染S1PR1 si-RNA或使用FTY720(100nmol/L)阻断S1PR1后使用S1P刺激,Real-time PCR检测CD86,i NOS,CD206,Arg1;流式细胞术CD86+M1和CD206+M2型细胞比例。3.Real-time PCR及western blot检测S1P刺激后巨噬细胞NLRP3炎症小体(NLRP3,ASC)的表达。4.使用FTY720(100nmol/L)或S1PR1 si-RNA阻断S1PR1后使用S1P刺激,Real-time PCR及western blot检测巨噬细胞NLRP3炎症小体表达。5.使用MCC950阻断NLRP3后使用S1P刺激,Real-time PCR检测CD86,i NOS,CD206,Arg1表达水平,流式细胞术检测CD86+M1和CD206+M2型细胞比例。结果:1.与正常对照组小鼠相比,MRL/lpr小鼠血清和肾脏中S1P水平升高;2.Real-time PCR结果显示,MRL/lpr小鼠肾脏表达S1PR1,S1PR2,S1PR3,S1PR4,其中S1PR1表达较正常对照组明显增加;3.小鼠尿蛋白检测结果显示,FTY720阻断S1PR1可以有效降低MRL/lpr小鼠蛋白尿水平并延缓疾病进程,与模型组小鼠血清Crea、Urea水平相比,阻断S1PR1可以降低血清Crea、Urea,减轻肾脏损伤;4.病理染色结果显示,FTY720组小鼠肾脏组织病理改变减轻,炎症细胞浸润减少;5.透射电镜结果显示,FTY720可以改善小鼠足细胞损伤,减少足细胞足突融合,增加裂隙孔数量;6.小鼠血清抗ds-DNA抗体ELISA检测结果显示,FTY720组MRL/lpr小鼠与模型组相比抗体浓度下降;免疫荧光实验结果显示,FTY720组小鼠肾脏IgG和C3免疫复合物沉积减少,整体生存率增加;7.免疫组织化学染色结果显示,与模型组MRL/lpr小鼠相比,FTY720组小鼠肾脏F4/80+巨噬细胞浸润减少,Real-time PCR结果显示FTY720可以抑制MRL/lpr小鼠肾脏炎症因子IL-6,TNF-α,IL-18的表达水平;8.Real-time PCR结果显示,FTY720组MRL/lpr小鼠肾脏M1型巨噬细胞标志物i NOS和CD86较模型组明显减低,免疫荧光染色结果显示,FTY720组MRL/lpr小鼠肾脏F4/80+CD86+巨噬细胞浸润减少;9.使用1μmol/L的S1P刺激RAW264.7,通过Real-time PCR检测巨噬细胞M1和M2型标志物表达水平,结果显示,S1P可以诱导巨噬细胞表达M1型标志物;流式细胞术结果显示,S1P刺激可以增加CD86的巨噬细胞比例;10.使用FTY720(100μmol/L)或者si-RNA阻断S1PR1可以抑制S1P诱导巨噬细胞向M1型极化;11.Real-time PCR和western blot结果显示,1μmol/L的S1P可以诱导NLRP3炎症小体激活,而使用FTY720或者si-RNA阻断S1PR1可以抑制这一现象;12.Real-time PCR和流式细胞术结果显示,使用MCC950阻断NLRP3可以抑制S1P诱导巨噬细胞向M1型极化。结论:1.S1P/S1PR1信号通路在MRL/lpr小鼠体内表达升高。2.阻断S1PR1可以改善MRL/lpr小鼠肾功能。3.阻断S1PR1可以改善MRL/lpr小鼠自身免疫情况。4.阻断S1PR1可以抑制MRL/lpr小鼠肾脏M1型巨噬细胞浸润从而减轻肾脏炎症。5.S1P/S1PR1信号通路促进巨噬细胞向M1型极化。6.S1P/S1PR1信号通路通过激活NLRP3炎症小体诱导巨噬细胞向M1型极化。