目的肾小管管周毛细血管内皮细胞向间充质转分化（EndMT）是新近发现的肾间质肌成纤维细胞的重要来源,其发生机制与内皮细胞紧密连接失去功能密切相关。研究表明蛋白丝/苏氨酸磷酸酶2A （PP2A）的催化亚单位C （PP2Ac）酪氨酸位点硝基化可激活PP2A并能下调紧密连接连接蛋白（Occludin）丝/苏氨酸位点磷酸化,从而参与内皮细胞紧密连接的功能调控。本研究探讨PP2Ac酪氨酸核心位点硝基化对内皮细胞紧密连接的影响,并阐明该位点是肾小管管周毛细血管EndMT的重要调控分子,参与进行性肾间质纤维化,为探索防治肾间质纤维化进行性发展的新治疗靶点提供实验依据。方法体外构建硝基化反应体系,用过氧化亚硝酸盐（Peroxynitrite）刺激重组的PP2Ac蛋白,western blotting收集对照组和刺激组中的蛋白行质谱检测,分析PP2Ac酪氨酸发生硝基化的具体位点。对上述硝基化位点进行计算机模拟分析以明确各位点空间暴露程度从而确定调控PP2A活性的核心位点。同时构建、合成以核心位点为中心的底物模拟多肽和对照多肽,体外实验中验证该多肽对EndMT的干预作用,体内实验首先应用活体成像技术检测多肽在小鼠体内的分布以及代谢状态,然后通过尾静脉联合腹腔多肽注射观察该多肽在UUO小鼠模型中对管周毛细血管EndMT的干预效应。结果：质谱检测分析PP2Ac发生硝基化的具体位点有Y284/267/265/218/130/127 。在这六个位点中,Y127在蛋白质空间结构、相邻氨基酸电荷分布上具有更稳定的空间表位优势,在PP2Ac活化过程中起核心作用。以127位点为中心构建及合成的可穿透性底物模拟多肽和对照多肽能够抑制TGF-β1诱导的EndMT。体外试验中,多肽在肝脏和肾脏中具有较高的药物积聚；较对照多肽,底物模拟多肽可明显抑制Occludin去磷酸化,减少EndMT发生,稳定外周毛细血管结构并部分减轻肾间质纤维化。结论以PP2Ac Y127为核心的底物模拟多肽可有效干预内皮细胞转分化,是肾间质纤维化治疗的潜在生物靶点。第一部分管周毛细血管EndMT是肾间质纤维化的重要组成部分目的在原发和继发性肾脏疾病以及UUO动物模型中探讨EndMT发生的证据,观察转化生长因子β1 （Transforming growth factor beta 1, TGF-β1）促进内皮细胞间充质转分化效应,探讨肾间质纤维化肌成纤维细胞内皮源性。方法选取原发性肾脏疾病（IgA肾病）以及继发性肾脏疾病（狼疮肾炎和糖尿病肾病）肾活检标本,应用血管内皮细胞特异性标志物CD31和肌成纤维细胞特异性标志物a-SMA行连续切片免疫荧光双标检测,并在阳性区域进行共聚焦三维结构重建明确CD31+a-SMA+共表达。体内实验采用C57小鼠单侧输尿管梗阻肾病模型,荧光双标结合三维重建观察CD31+a-SMA+共表达情况。体外实验采用TGF-β1 （lOng/ml）刺激人脐静脉内皮细胞72h建立EndMT细胞模型,镜下观察细胞形态变化,免疫荧光及western blot检测血管内皮钙粘素（VE-cadherin,内皮特异性标志物）和平滑肌肌动蛋白（a-SMA）表达变化。结果和对照组相比,在IgA肾病、狼疮肾炎、糖尿病肾病以及UUO动物模型肾间质纤维化区域,管周毛细血管管腔异常膨大或缩小;共聚焦显微镜下观察发现CD31和α-SMA共表达增多,差异具有统计学意义（P<0.05）；对该共表达部位血管进行三维立体重建,发现部分内皮细胞可表达α-SMA。体外实验,TGF-β1刺激72h后,内皮细胞形态由铺路石状向梭型转化,细胞与细胞间距明显增大;和对照组相比,肌成纤维细胞标志物α-SMA表达显著增加,而内皮细胞标志物VE-cadherin表达下调,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论在原发和继发性肾脏病中,内皮细胞间充质转分化是肾间质纤维化肌成纤维细胞的重要组成部分。内皮细胞受到促纤维化因子刺激后,细胞表型和功能特性均可向间充质细胞转化。第二部分PP2A活化及PP2Ac硝基化对EndMT的作用研究目的探讨内皮细胞PP2A活化及PP2Ac硝基化对EndMT进程的影响方法（1）提取UUO小鼠不同梗阻时间点下肾脏组织蛋白以及不同TGF-β1刺激时间点下细胞总蛋白,继而用丝／苏氨酸蛋白磷酸酶活性试剂盒监测PP2A的活性变化;（2）采用PP2A特异性抑制剂冈田酸（Okadaic acid, OA）预处理后,观察TGF-β1刺激下α-SMA、VE-cadherin蛋白表达变化以及PP2A底物紧密连接蛋白Occludin磷酸化水平;（3） PP2Ac是PP2A的活性亚基,运用免疫组化及免疫荧光定位PP2Ac在肾脏组织的表达,并通过免疫共沉淀检测TGF-β1刺激下内皮细胞PP2Ac翻译后修饰变化及其对PP2A磷酸酶活性的影响。结果（1）和对照组相比,随着梗阻时间延长,PP2A活性逐渐增加并在UUO-14d达到峰值;体外实验,TGF-β1刺激下,PP2A的活性在15min开始升高,在60min时显著增强（P<0.05） 。 （2） western blot结果显示较TGF-β1组,OA干预组α-SMA表达显著下调而VE-cadherin表达显著上调；免疫共沉淀示正常HUVE细胞紧密连接蛋白Occludin磷酸化水平维持在较高水平,TGF-β1刺激72h后磷酸化水平明显降低,OA预处理后可部分抑制Occludin磷酸化减少（P<0.05）。（3）免疫荧光检测可见PP2Ac主要在肾小球及肾间质毛细血管内皮细胞表达；与对照组相比,PP2Ac蛋白表达量并无显著改变,但是PP2Ac硝基化水平明显升高;和其他翻译后修饰相比,PP2Ac硝基化可明显上调PP2A磷酸酶活性（P<0.05）。结论PP2A激活可破坏内皮细胞稳定性,促进EndMT的发生,抑制PP2A活性可减弱EndMT效应。PP2Ac硝基化是内皮细胞PP2A活性增强的主要原因,提示PP2Ac硝基化在内皮细胞转分化中发挥重要的促进作用。第三部分PP2Ac Y127硝基化在EndMT中的作用研究目的前期研究表明蛋白丝/苏氨酸磷酸酶2A （PP2A）的催化亚单位C （PP2Ac）硝基化可激活PP2A并能下调紧密连接蛋白Occludin丝/苏氨酸位点磷酸化,从而参与内皮细胞紧密连接功能调控。本部分研究探讨PP2Ac酪氨酸硝基化具体位点及核心位点,并阐明该位点是肾小管管周毛细血管EndMT的关键调控位点,参与进行性管周毛细血管萎缩,为探索防治肾间质纤维化提供潜在的治疗靶点和干预策略。方法 （1）体外构建硝基化反应体系,用过氧化亚硝酸盐（Peroxynitrite）刺激重组PP2Ac蛋白,western blot收集对照组和刺激组中的蛋白行质谱检测,分析PP2Ac酪氨酸发生硝基化的具体位点。（2）对上述硝基化位点进行计算机模拟分析以明确各位点空间暴露程度从而确定调控PP2A活性的核心位点。同时构建以酪氨酸硝基化位点为中心的底物模拟多肽,偶联TAT穿膜肽,采用化学合成法获得融合多肽。（3）为了验证多肽是否能够顺利穿透进入内皮细胞,高效运载PP2Ac活性片段,我们运用FITC标记该多肽。将多肽与HUVECs共培养72小时后,荧光显微镜下观察该多肽细胞内荧光强度并采用CCK8法筛选最佳细胞药物浓度。（4）体外实验验证上述多肽对EndMT的干预效应,进一步明确PP2Ac核心位点。结果（1）质谱结果显示,对照组仅检测出一个硝基化位点Y218,实验组PP2Ac硝基化位点增加至六个：Y284/267/265/218/130/127.计算机模拟分析显示,在这六个位点中,Y127在蛋白质空间结构、相邻氨基酸电荷分布上具有更稳定的空间表位优势,在PP2Ac活化过程中可能起核心作用。（2）以构建的TAT-127WT融合多肽为例,携带荧光标记的多肽可渗透进内皮细胞且可持续到实验终点时间72h,对内皮细胞具良好的穿透效率。CCK8法检测不同浓度下该多肽的细胞毒性,结果表明在5-10uM浓度下该多肽不仅具有良好的穿透性,对细胞的毒性作用最低。因此,在后续的细胞实验中选择10uM进行研究。（3）以各位点为中心构建合成的可穿透性底物模拟多肽抑制TGF-β1诱导的EndMT效应依次为：Y127>Y265>Y130>284>Y267。结论酪氨酸127是PP2Ac硝基化及PP2A活化的关键位点,以该位点为核心构建的底物模拟多肽可有效抑制EndMT,可能是管周毛细血管病变、间质纤维化治疗的潜在生物靶点。第四部分TAT-Y127WT对EndMT的体内外干预研究目的前期研究表明,PP2Ac Y127是PP2A全酶活性的核心位点,以PP2Ac Y127为中心构建的底物模仿多肽较其他位点具有更显著的抑制EndMT效应。本部分研究进一步探讨TAT-Y127WT及其对照多肽TAT-Y127Scr对内皮细胞转分化的体内外干预效应,为肾间质纤维化的治疗提供实验依据和策略。方法（1）合成以PP2Ac Y127为中心的底物模拟多肽（TAT-127WT）和对照多肽（TAT-127Scr）,预处理HUVECs 30min,给予TGF-β1 （10ng/ml）刺激72h, western blot检测a-SMA、VE-cadherin蛋白表达变化及PP2A底物Occludin磷酸化水平。（2）运用活体动物成像技术,在多肽注射前、注射后30min、4h及24h观察其在体内的代谢情况。同时在相应时间点取出重要器官和组织进行示踪。（3）尾静脉联合腹腔注射（5 nmol/g,术前一次、术后1次／天）,2周后观察该多肽对UUO模型鼠肾脏管周毛细血管内皮细胞EndMT的干预效应,免疫组化观察α-SMA、Vimentin沉积情况。结果（1） Western blot结果显示TAT-127WT组较TGF-β1组、TAT-127Scr组,a-SMA表达显著下调,而VE-cadherin和occludin磷酸化水平显著上调,差异具有统计学意义（P<0.05） 。 （2） TAT-127WT在体内的代谢速度较快,4h后不足10%,24h后完全从体内代谢。肝脏和肾脏药物的富集程度较高,心、肺、脾脏程度低。检测血液中荧光强度进一步证明该融合多肽的半衰期大约为2.5h。（3）较对照组,经Y127WT干预后,肾组织微血管密度上调,具有一定EndMT抑制效应。免疫组化结果显示,干预组能够部分减少α-SMA、Vimentin在肾间质中的表达和积聚,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论通过抑制EndMT,以PP2Ac Y127为核心的底物模拟多肽对UUO小鼠肾小管管周毛细血管病变具有一定的改善作用,为肾间质纤维化治疗提供了新的思路。