脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus,EMCV）是心病毒属（Cardiovirus）的一种小核糖核酸病毒。该病毒主要引起心肌炎、糖尿病、神经系统和生殖系统疾病,可感染包括猪在内的多种哺乳动物,是一种人兽共患病病原。目前,国内尚无标准的EMCV核酸检测方法,且临床感染EMCV后尚无特异性治疗药物。因此,建立该病毒的快速检测方法、筛选抗病毒药物,具有重要意义。本研究主要开展了基于CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）-Cas13a的EMCV横向流动试纸条检测方法和脱氢表雄酮（Dehydroepiandrosterone,DHEA）衍生物抗病毒药物筛选的研究,主要研究内容与结果如下:1.EMCV的CRISPR-Cas13a横向流动试纸条检测方法的初步建立首先,选取EMCV结构蛋白VP1基因作为检测靶基因,建立EMCV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法,检测下限可达1×10~1copies/μL,具有较好重复性及高特异性。其次,筛选能稳定扩增EMCV VP1基因的重组酶介导等温核酸扩增（Recombinase aided amplification,RAA）引物,然后基于RAA引物设计同样靶向VP1基因的cr RNA（CRISPR RNA）序列;利用cr RNA结合并引导Cas13a蛋白对各来源RNA识别处理,特异性地检测出EMCV VP1基因。在此基础上,结合Cas13a试纸条试剂盒检测方法,建立了针对VP1基因快速可视化的CRISPR-Cas13a试纸条检测方法,其敏感度下限达到1×10~2copies/μL,与传统荧光定量方法相近;检测时长仅需85min,较传统荧光定量方法缩短超过60min;利用该方法检测其他7种猪源病毒,并与传统荧光定量PCR方法进行比较,结果表明,二者均可特异性检测EMCV,具有较好的特异性。上述研究表明,本研究初步建立了EMCV的CRISPR-Cas13a横向流动试纸条检测方法,为EMCV的临床快速检测试剂盒研制奠定了基础。2.抑制EMCV复制的DHEA衍生物分子筛选首先,将9种DHEA衍生物稀释至10μM,在EMCV易感细胞BHK-21细胞上进行抗病毒分子的初步筛选。结果发现,AV4001、AV4005及AV4006三个衍生物分子具有显著抑制EMCV的能力。其次,选取AV4001、AV4006进行细胞毒性和抗病毒效果测定,结果表明,AV4001对细胞无毒性的最高浓度为10μM,AV4006对细胞无毒性的最高浓度为200μM;二者对EMCV抑制作用均具有剂量依耐性,IC50分别为:9.324μM及325.8μM.,选择指数（Selectivity index,SI）分别为22.40和1.87。在此基础上,进一步研究AV4001、AV4006抑制EMCV复制的机制,结果表明,当EMCV感染细胞后再添加AV4001或AV4006,抗病毒的效果最显著,且两衍生物不影响的EMCV吸附入侵细胞,说明二者的抗病毒作用可能主要发生在病毒的复制阶段。3.DHEA衍生物AV4001抗病毒作用的体内评价选取抗病毒效果最强的AV4001衍生物分子,通过小鼠感染模型,进一步在体内验证该分子的抗病毒效果。选择48只6周龄BALB/C小鼠,随机分为3组:EMCV+DMSO、EMCV+AV4001、DMEM+AV4001。每组16只小鼠,第0天腹腔注射10~4TCID50 EMCV或等体积DMEM,并从第0天开始连续给药（50 mg/kg AV4001）或等体积的DMSO至第3天,连续观察小鼠症状至第14天。在第3天每组收集5只小鼠组织样品,剩余11只小鼠用于临床症状观察及存活率计算。小鼠感染实验表明,EMCV+DMSO组小鼠死亡率为100%,感染小鼠出现严重的神经症状并快速死亡;EMCV+AV4001组小鼠死亡率为72.73%,除猝死小鼠外,其他死亡小鼠神经症状不明显;DMEM+AV4001组无小鼠死亡且无症状。临床症状评价和组织TCID50病毒载量检测结果表明,AV4001治疗能降低小鼠死亡率,减轻小鼠临床症状,减少小鼠脑组织中EMCV病毒载量。H&E染色结果显示,EMCV+DMSO组小鼠脑组织中出现明显的血管袖套和小胶质细胞结节现象,而EMCV+AV4001治疗组小鼠脑组织中无明显炎症反应。该研究表明,AV4001在体内对EMCV感染具有一定的治疗效果。本研究初步建立了适用于临床快速检测的CRISPR-Cas13a EMCV试纸条检测方法,筛选到了一种具有抑制EMCV复制的DHEA衍生物分子,为EMCV快速检测试剂盒和治疗药物研发奠定了基础。