【摘 要】
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刚地弓形虫作为一种严格的专性细胞内寄生原虫,可以感染包括人在内的几乎所有温血动物的有核细胞。弓形虫入侵宿主细胞会诱导I型干扰素产生,同时也会存在相关机制抑制I型干扰素的产生。现已有的研究表明I型干扰素在控制弓形虫感染中发挥重要作用,但目前对于抑制I型干扰素产生的相关机制研究却相对较少。在感染宿主的过程中,弓形虫会分泌效应蛋白参与免疫逃避以利于虫体在宿主细胞内生长。弓形虫入侵宿主细胞时其棒状体会分泌
【基金项目】
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国家重点研发计划“弓形虫病现场诊断技术与基因缺失疫苗研究”（2017YFD0501304）；
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刚地弓形虫作为一种严格的专性细胞内寄生原虫,可以感染包括人在内的几乎所有温血动物的有核细胞。弓形虫入侵宿主细胞会诱导I型干扰素产生,同时也会存在相关机制抑制I型干扰素的产生。现已有的研究表明I型干扰素在控制弓形虫感染中发挥重要作用,但目前对于抑制I型干扰素产生的相关机制研究却相对较少。在感染宿主的过程中,弓形虫会分泌效应蛋白参与免疫逃避以利于虫体在宿主细胞内生长。弓形虫入侵宿主细胞时其棒状体会分泌一类具有激酶/激酶样结构域的棒状体蛋白,该类蛋白中大多数参与虫体入侵、复制、毒力和免疫逃避等生理活动,故这类蛋白极有可能是抑制宿主产生I型干扰素的效应蛋白。本研究利用双荧光素酶检测系统从构建成功的17种棒状体蛋白重组质粒中筛选出抑制SEV诱导的IFN-β启动子活性效果更显著的棒状体蛋白ROP18,并深入探究了ROP18抑制IFN-β产生的具体作用机制,主要研究结果如下:（1）抑制SEV诱导IFN-β产生的棒状体蛋白的筛选将数据分析筛选并构建成功的17种棒状体蛋白真核重组质粒转染HEK-293T细胞,感染SEV后利用双荧光素酶系统检测IFN-β启动子活性,发现过表达两种棒状体蛋白TGGT1＿291960和TGGT1＿205250（ROP18）能显著抑制SEV诱导的IFN-β启动子激活,其中TGGT1＿205250（ROP18）抑制效果更显著。（2）ROP18抑制TBK-1介导的RLR信号通路NF-κB和IRF3是调控IFN-β产生的两个重要的转录因子。为了探究ROP18蛋白是否抑制NF-κB和IRF3启动子的激活,将ROP18真核重组质粒转染HEK-293T细胞,感染SEV后利用双荧光素酶系统检测发现ROP18抑制SEV诱导的IRF3启动子的活性,但不抑制SEV诱导的NF-κB启动子的活性。SEV是一种能强烈诱导RLR通路介导IFN-β产生的刺激物。ROP18蛋白抑制SEV诱导的IFN-β和IRF3启动子激活,可能是由于ROP18靶向了RLR信号通路中的某一个或多个接头分子。为了研究ROP18是否与RLR信号通路中相关蛋白作用抑制IFN-β产生,将ROP18真核表达质粒与RLR信号通路关键分子RIG-IN、MDA-5、MAVS、TBK-1、IKKε、IRF3-5D的真核质粒分别共转染HEK-293T细胞,双荧光素酶检测发现ROP18抑制RIG-IN、MDA-5、MAVS、TBK-1诱导的IFN-β启动子激活,但不抑制IKKε、IRF3-5D诱导的IFN-β启动子激活,提示TBK-1可能是ROP18潜在靶标。Western blot检测结果显示与对照组相比,共转染ROP18和TBK-1真核质粒后TBK-1的蛋白量明显减少。同时,通过免疫共沉淀（Co-IP）实验发现ROP18与TBK-1之间不存在直接相互作用。（3）ROP18与TBK-1的作用机制为了研究ROP18影响TBK-1蛋白量的作用方式,首先将pc DNA3.1-ROP18-3HA或pc DNA3.1-3HA转染HEK-293T细胞,利用q RT-PCR分析发现ROP18不抑制TBK-1的转录。故推测ROP18是通过诱导TBK-1蛋白降解影响其蛋白量水平。通过文献发表的ROP18结构将ROP18分成两个截短突变体（ROP18-N:43-244aa、ROP18-C:245-554aa）。将两个截短的ROP18真核表达质粒与TBK-1共转染,Western blot检测结果显示ROP18-N截短片段是降解TBK-1蛋白的关键区域。当使用蛋白酶体抑制剂MG-132后,利用Western blot检测,发现使用MG-132后的TBK-1蛋白含量没有明显增多,这提示ROP18可能是通过其他途径降解TBK-1蛋白,进而抑制IFN-β启动子激活。本研究筛选出显著抑制SEV诱导IFN-β启动子激活的棒状体蛋白TGGT1＿291960和TGGT1＿205250（ROP18）,其中TGGT1＿205250（ROP18）抑制效果更显著。ROP18抑制RLR信号通路IFN-β的产生,对其机制深入研究后发现TBK-1可能是ROP18的潜在靶标,并且两者之间不存在直接相互作用。ROP18通过降解而非抑制转录影响了TBK-1的蛋白量水平,诱导TBK-1降解的关键区域是ROP18-N截短片段,但降解的途径可能不是泛素-蛋白酶体途径。以上研究为寻找其他抑制宿主产生I型干扰素的靶蛋白提供思路,以及为防控弓形虫感染提供理论支撑。
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