论文部分内容阅读
胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,其特点是早期不易诊断,预后较差的特性,因此严重的危害到人类生命健康。已有研究表明表观遗传学可能在胃癌的起因和生长过程中起到重要作用,N6-甲基腺嘌呤修饰(m~6A)是一种在真核生物中最普遍的RNA转录后修饰调控,其主要参与蛋白包括被称作“writers”的甲基化酶,“erasers”去甲基化转移酶和“readers”m~6A识别蛋白。目的:为研究m~6A识别蛋白YTHDF1和YTHDF2与胃癌之间的关系,通过敲降YTHDF1和YTHDF2在胃癌细胞中的mRNA和蛋白质表达水平后观察是否对胃癌细胞的功能产生影响,为其在胃癌发生发展提供体外实验佐证,建立胃癌与m~6A甲基化修饰的关系。方法:通过UCSC Cancer Browser下载癌症基因组图谱(TCGA)数据库中RNA-seq数据并筛查YTHDF1、YTHDF2在胃癌中的表达情况。设计并构建能够靶向特异性敲低YTHDF1、YTHDF2的短发卡RNA(shRNA)的慢病毒重组载体;用HEK-293T细胞包装合成含有靶向shRNA的敲低病毒,继而感染相应的胃癌细胞系。通过Real-Time RCR验证相应的mRNA表达水平,Western blot法验证相应的蛋白表达水平。将验证合格的胃癌细胞进一步做细胞相关功能实验,CCK-8法检测胃癌细胞的增殖能力,transwell法检测胃癌细胞迁移和细胞侵袭能力,流式细胞术法检测胃癌细胞周期和凋亡情况。将成功敲低MGC-803內源性YTHDF1蛋白水平的细胞提取总RNA后进行二代测序后通过生物信息分析筛选出差异基因。结果:通过TCGA数据库查询发现YTHDF1、YTHDF2在胃癌组织样品中表达量均高于正常组织。成功构建了YTHDF1、YTHDF2的靶向敲低重组质粒,成功包装相应的慢病毒并将其感染至MGC803和HGC-27胃癌细胞系。与对照组相比,敲低MGC-803和HGC-27胃癌细胞系中YTHDF1的表达水平后,细胞增殖能力明显受到抑制;细胞侵袭能力和迁移能力也受到抑制;将YTHDF1-shRNA稳定表达的MGC-803细胞进行高通量测序共发现360个表达有变化的差异基因,其中上调基因197个、下调基因163个。敲低胃癌细胞MGC-803中YTHDF2的表达水平后,细胞增殖能力明显受到抑制;同时胃癌细胞周期的G1期细胞数目明显增加,S期的细胞数目则明显减少;细胞凋亡率升高。结论:敲低胃癌细胞MGC-803和HGC-27中YTHDF1的表达水平后,能够抑制细胞增殖,同时抑制细胞迁移能力和侵袭能力;敲低胃癌细胞系MGC-803中YTHDF2的表达水平后,能够抑制细胞增殖并促进细胞凋亡的发生。