研究背景在表观遗传学领域,RNA化学修饰成为继DNA修饰和组蛋白甲基化之后的又一研究热点。RNA修饰是一种转录后水平的调控方式,目前已鉴定到一百多种RNA修饰,它们广泛分布于各类RNA上,与RNA功能联系密切。其中甲基化修饰是RNA修饰的主要形式,约占RNA修饰总量的三分之二。研究发现,RNA甲基化修饰在哺乳动物脑中含量丰富,参与神经系统发育,且有着独特的甲基化模式和功能。到目前为止,真核生物RNA上的N~6-甲基腺嘌呤（N~6-methyladenosine,m~6A）和5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine,m~5C）是神经科学领域研究最多的两种RNA化学修饰。近年来的研究表明,m~6A在不同类型的细胞中分布多样,在调控RNA剪接、稳定性、翻译和二级结构等方面发挥着重要作用。与m~6A类似,m~5C也被发现存在于多种RNA中,具有调节核mRNA输出及RNA可变剪切、增强RNA稳定性和维持RNA正常结构等作用。RNA化学修饰在神经系统中的作用值得深入调查,在转录组中广泛存在的RNA m~6A和m~5C修饰暗示了它们在不同的生物过程中的功能作用。研究目的探究在小鼠神经元中RNA m~6A和m~5C的特异性甲基化模式。研究方法选用年龄为8-12周,体重为20-25g的雄性C57/BL6小鼠为本研究的在体动物模型;体外培养C57/BL6小鼠胚胎（E16-E18）的原代皮层神经元作为本研究的离体细胞模型。首先,采用KCl诱导的去极化方案来模拟体外神经元活动,用定量PCR法检测被激活的神经元中,m~6A关键酶mRNA水平的变化。接下来,使用慢病毒感染细胞的方法分别敲低原代皮层神经元中m~6A去甲基化酶脂肪和肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-asso ciated protein,FTO）和ALKB同源蛋白5（alk B homolog 5,ALKBH5）,并运用RNA甲基化免疫共沉淀测序技术（methylated RNA immunoprecipitation sequencing,MeRIP-seq）,绘制出不同条件下的小鼠原代皮层神经元的m~6A甲基化图谱。然后敲低小鼠腹内侧前额叶皮层的前边缘皮层（the prelimbic cortex of the medial prefrontal cortex,mPFC-PrL）区域ALKBH5的表达,探究下调mPFC-PrL中的ALKBH5,小鼠对情境和提示恐惧条件反射的记忆巩固的影响。除此之外,还应用RNA亚硫酸盐测序（RNA bisulfite treatment sequencing,RNA BS-seq）,对KCl处理后的小鼠原代皮层神经元进行了全基因组分析,绘制其m~5C甲基化图谱。研究结果1)在被KCl激活的小鼠原代皮层神经元中,m~6A去甲基化酶ALKBH5和FTO的mRNA水平均被上调;2)KCl诱导原代皮层神经元去极化引起mRNA上m~6A位点向3’UTR偏移;3)m~6A去甲基化酶FTO和ALKBH5在小鼠原代皮层神经元中参与的生物学功能和信号通路有差异;4)敲低小鼠mPFC-PrL中的ALKBH5,影响了小鼠的远期记忆,暗示着ALKBH5在长时程记忆的形成过程中发挥重要作用;5)KCl诱导原代皮层神经元去极化引起RNA m~5C动态变化;6)RNA m~5C甲基化参与被激活神经元中RNA转运和局部翻译。研究结论本研究揭示了小鼠皮层神经元中RNA m~6A和m~5C甲基化修饰的特异性,绘制了不同状态下的小鼠原代神经元的甲基化图谱,为进一步探索RNA修饰的在神经元中的生物学功能奠定了基础。