论文部分内容阅读
研究背景:心血管疾病作为人类“寿命损失”影响因素的首因,在我国已占居民疾病死亡总数的44%以上。尽管临床药物和介入治疗取得了很大进展,但心肌梗死仍然是心血管病发病和死亡的主要病因。全程关注心血管疾病的前期预防、临床救治和后期康复,是降低心血管疾病发病率和死亡率的重要思路。文献表明,适宜运动可有效预防心血管疾病,对心梗心脏康复也发挥重要作用,但其康复机制尚未完全阐明。开展运动与心梗心脏康复及其机制研究,将为体医融合背景下,筛选缺血心脏运动康复方法及其作用靶点提供理论和实验依据。间歇低氧适应可显著增加心脏的缺氧耐受,缓解心肌缺血损伤带来的多种临床表现。适宜的间歇低氧和运动干预作为非药物性心脏康复手段,具有方法简便、易于应用且无明显副作用的优点,但对改善心梗心功能效应的比较及其作用机制研究,尚缺乏文献支持。miRNA在缺血心脏修复过程中发挥重要作用。本文采用文献法已筛选到运动、心梗心脏与血管新生相关的7条miRNAs,包括促血管新生的miR-126、miR-130a、miR-17-5p 和抗血管新生的 miR-15b、miR-16、miR-221、miR-222。但目前尚缺乏对这些miRNAs在运动与心梗心肌血管新生与心功能改善方面的实验研究。低氧条件下HIF-1α可调控包括miRNA在内的诸多基因表达,发挥血管新生效应。运动可显著升高缺血心脏HIF-1α的表达,但HIF-1α和miRNA在运动诱导心梗心肌血管新生中的作用及其机制,目前尚缺乏文献报道。研究目的:(1)明确运动和间歇低氧干预对心梗心肌HIF-1α和miR-126表达的影响。(2)揭示HIF-1α和miR-126在运动促进心梗心肌血管新生,改善心功能中的作用及其机制。研究方法:(1)在体动物实验分组:3月龄SD大鼠(购自西安交通大学实验动物管理中心),体重180-220g,采用小动物呼吸肌和麻醉机吸入麻醉与辅助呼吸,左冠脉前降支结扎法制备心梗模型,假手术组组仅穿线不结扎。术后1周进行运动、低氧或药物注射干预。将大鼠随机分为假手术组(S)、心梗组(MI)、心梗+间歇运动组(MIE)、心梗+持续运动组(MCE)、心梗+间歇低氧组(MIH)、心梗间歇运动+HIF-1α抑制剂组(MIE+2ME2)、心梗间歇运动+PBS组(MIE+PBS)。干预结束后次日测试心功能,腹主动脉取血,断头处死,取材。(2)离体细胞实验分组:采用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分为低氧干预、HIF-1α抑制剂或激动剂干预、内源性干预。HUVEC细胞低氧干预分为:常氧组、低氧1h组、低氧2h组、低氧3h组、低氧4h组、低氧6h组、低氧8h组、低氧12h组、低氧24h组,共9组;HUVEC细胞低氧与药物干预分为:常氧对照组,常氧+2ME2组,常氧+HIF-1α激动剂(DMOG)组,低氧对照组,低氧+2ME2组,低氧+DMOG组共6组;HUVEC细胞内源性干预分为:常氧对照组,低氧对照组,低氧+miR-126 mimics组,低氧+miR-126 Inhibitor 组,低氧+mimics Control 组,低氧+Inhibitor Control组共6组。293T 工具细胞分为:PGL4.1-basic 组,miR-126-promoter+DMOG 组,miR-126-promoter+HIF-1α 组,miR-126-promoter+HIF-1α+DMOG 组共 4 组。(3)测试指标:颈动脉插管心脏血流动力学测定大鼠心功能;Masson染色观察分析心肌胶原容积分数(CFV);免疫组化观察CD31和α-SMA表达;免疫荧光法观察 PCNA+/vWF+阳性颗粒;RT-qPCR 检测 miR-126、miR-130a、miR-17-5p、miR-15b、miR-16、miR-221、miR-222、egfl7、pik3r2和 spred1表达,Western Blotting检测 HIF-1α、PIK3R2、SPRED1、VEGF、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS、Raf-1和p-ERK/ERK表达;HUVEC细胞培养CCK-8检测细胞活性;荧光强度检测验证细胞转染效率;细胞划痕和HUVEC小管形成实验检测细胞迁移分化和小管形成能力;双荧光素酶报告基因检测转录因子和启动子结合。研究结果:(1)心梗大鼠心肌miR-222表达显著上调(P<0.05),miR-126表达显著下调(P<0.05);运动干预后显著上调心梗心肌组织miR-126和miR-17-5p表达(P<0.05,P<0.01),其中 miR-126 表达变化更显著,而 miR-15b、miR-16、miR-221、miR-222和miR-130a表达均无显著性变化。(2)运动干预可显著下调心梗心肌组织miR-126靶基因pik3r2 mRNA和PIK3R2蛋白表达(P<0.05,P<0.01)、下调spred1mRNA及SPRED1蛋白表达(P<0.01,P<0.05),且间歇运动的抑制效应优于持续运动干预。(3)IET干预可显著上调心梗心肌组织miR-126宿主基因egfl7的表达(P<0.01),且 与 miR-126 表达变化关系密切(R=0.65,P<0.05)。(4)CD31免疫组化的MVD结果显示,与S组比较,MI组显著升高(P<0.05);与MI组比较,MIE组显著升高(P<0.05)。VEGF的蛋白表达结果显示,与S组比较,MI组表达显著上调(P<0.05),与MI组比较,MIE组表达显著上调(P<0.01)。结果表明心梗后心肌梗死边缘区发生代偿性血管新生,运动干预可促进梗死边缘区的血管新生,且间歇运动干预更显著。(5)α-SMA免疫组化的IOD结果显示,与MI组比较,MIE组表达显著升高(P<0.05)。结果表明间歇运动干预可使梗死边缘区VSMC发生表型逆转,由合成型转化为收缩型。(6)血流动力学指标结果显示,与MI组比较,MIE组和MCE组LVSP均显著升高(P<0.05),LVEDP均显著降低(P<0.05);心肌CVF统计结果显示,与MI组比较,MIE组显著降低(P<0.01)。结果表明间歇运动干预显著抑制心梗边缘区胶原纤维过度增生,显著改善心梗心功能,且效果优于持续运动干预。(7)与MIH组比较,MIE心肌PCNA+/vWF+双阳性表达和LVSP均显著升高(P<0.01,P<0.05),心肌 HIF-1α 蛋白和 miR-126 表达均显著上调(P<0.01)。结果表明间歇运动干预促进心梗心肌血管新生优于间歇低氧干预。(8)与MIH组比较,MIE大鼠心脏重量、心胫比和LVEDP均显著降低(P<0.01,P<0.01,P<0.05),LVSP显著升高(P<0.05)。结果表明间歇运动干预改善心梗心功能的效果优于间歇低氧干预。(9)离体HUVEC细胞实验结果表明,随着低氧时间的延长,HIF-1α蛋白表达先升高后降低,在低氧2h表达出现峰值,miR-126表达结果与HIF-1α高度一致。提示HIF-1α与miR-126之间可能存在调控关系。(10)与 MIE 组比较,MIE+HIF-1α 抑制剂(2ME2)组 CVF、LVEDP 均显著升高(P<0.05),PCNA+/vWF+双阳性细胞数、LVSP均显著降低(P<0.01,P<0.05),HIF-1α 蛋白和 miR-126 表达均显著下调(P<0.01),PIK3R2 和 SPRED1蛋白表达均显著上调(P<0.01)。结果表明HIF-1α显著抑制miR-126表达并促进其靶蛋白上调,且在心梗心肌纤维化、血管新生和心功能改善中发挥重要作用。(11)生物信息学分析发现,miR-126上游启动子区域存在HIF-1α的结合位点;双荧光素酶报告基因检测结果发现,与miR-126-promoter+DMOG组比较,miR-126-promoter+HIF-1α 组和 miR-126-promoter+HIF-1α+DMOG 组荧光强度均显著升高(P<0.01)。HUVEC细胞实验发现,与对照组比较,常氧条件下DMOG以浓度依赖方式显著上调HIF-1α蛋白和miR-126的表达,低氧条件下2ME2以浓度依赖性方式显著下调HIF-1α蛋白和miR-126的表达(P<0.05)。结果表明HIF-1α与miR-126上游启动子区域结合,并促进其转录表达。(12)低氧干预组HUVEC细胞小管形成长度统计结果表明,与Mimics Control组相比,miR-126 Mimics组显著升高(P<0.01);与Inhibitor Control组比较,miR-126 Inhibitor组显著降低(P<0.05);低氧干预组HUVEC细胞划痕实验表明,与Mimics Control组比较,miR-126 Mimics组迁移率显著提高(P<0.01);与Inhibitor Control组比较,miR-126 Inhibitor组显著下降(P<0.05)。结果表明 miR-126在低氧诱导的HUVEC细胞小管形成和细胞迁移中发挥重要作用。(13)低氧干预 HUVEC 细胞发现,与 Mimics Control 组比较,miR-126 Mimics组PIK3R2蛋白表达显著降低(P<0.01),PI3K、Akt和eNOS的磷酸化水平显著升高(P<0.01);与 Inhibitor Control 组比较,miR-126 Inhibitor 组 PIK3R2 蛋白表达显著升高(P<0.01),PI3K、Akt和eNOS的磷酸化水平显著降低(P<0.01)。结果表明低氧条件下miR-126通过下调PIK3R2,激活PI3K/Akt/eNOS血管新生通路。(14)低氧干预 HUVEC 细胞发现,与 Mimics Control 组比较,miR-126 Mimics组SPRED1蛋白表达显著降低(P<0.01),Raf-1蛋白表达显著升高(P<0.01),ERK 磷酸化水平显著升高(P<0.05);与 Inhibitor control 组比较,miR-126 Inhibitor组SPRED1蛋白表达显著升高(P<0.01),ERK的磷酸化水平显著降低(P<0.01)。结果表明低氧条件下miR-126通过下调SPRED1,激活MAPK血管新生通路。研究结论:(1)运动可显著上调心梗心脏miR-126表达,抑制其下游靶蛋白PIK3R2/SPRED1表达,促进心脏梗死边缘区血管新生,抑制心梗心肌纤维过度增生,修复心梗心脏,且间歇运动的修复作用优于持续运动。(2)间歇运动和间歇低氧干预上调心梗心肌HIF-1α和miR-126表达,促进心肌血管新生,改善心功能,且间歇运动产生的效果要优于间歇低氧。(3)间歇运动通过HIF-1α直接作用于miR-126上游启动子区域并促进其转录表达,miR-126通过调控其靶蛋白PIK3R2和SPRED1表达,进一步激活VEGF介导的心梗心肌PI3K/Akt/eNOS和MAPK血管新生信号通路,发挥心梗心脏修复作用,且这种修复作用可被HIF-1α抑制剂2ME2所抑制。综上表明,间歇运动产生的低氧效应上调心梗心肌HIF-1α表达,HIF-1α直接作用于miR-126上游启动子区域并促进其转录表达,miR-126通过作用于其靶蛋白PIK3R2/SPREDI,进一步激活VEGF介导的PI3K/Akt/eNOS和MAPK血管新生信号通路,刺激心梗心肌血管新生,改善心梗心脏心功能。