目的:急性肝衰竭（acute liver failure,ALF）是我国乃至全世界重症肝病患者预后不良的最主要原因之一,国内外肝病患者死亡率高达90%。目前西医用来治疗急性肝衰竭的主要治疗方法只是原位肝移植,但肝移植后易出现的肝细胞铁死亡、免疫排斥反应等严重阻碍其发展,因此寻找新的治疗急性肝衰竭的方法是临床面临的关键问题。骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells,BMSCs）的移植创伤性小,增殖分化能力强、且适合自体移植,其可以特异性归巢到肝脏损伤组织,近年来成为急性肝衰竭治疗新的研究热点。但是BMSCs移植面临的关键问题是肝损伤组织处内环境紊乱,不利于BMSCs移植后生存,BMSCs往往易出现铁死亡,因此改善移植后易引起铁死亡的恶劣环境,提高BMSCs移植后存活率,是提高BMSCs治疗ALF疗效的关键因素。部分中药具有改善机体内环境紊乱,抗细胞死亡的作用。其中,中药丹参就具有一定的抗氧化和抗细胞死亡作用,其主要成分丹酚酸B可以显著抑制肝线粒体和肾线粒体脂质过氧化,减少细胞损伤凋亡。近年来本课题组探讨了中药丹酚酸B对各类干细胞的作用,积累了丰富的工作基础。近年来的研究及我们前期研究均发现丹酚酸B不仅具有清除自由基抗氧化作用,还能促干细胞分化等。因此,我们推测其对于改善BMSCs移植后引起的铁死亡恶劣环境,及提高BMSCs移植后存活率有一定效果。前期探索实验发现,丹酚酸B可抗BMSCs铁死亡,这表明我们推测的丹酚酸B能提高BMSCs移植后存活率的假说可能成立,为探究其机制,我们进行了进一步研究。在机制研究中,众多miRNA可产生重要的调控作用,其中多种miRNA在细胞凋亡和铁死亡中发挥作用,mir-582-3p是众多miRNA的重要一员,其在肝脏细胞癌中起着抑制作用,并在多种癌症调控机制中起到调控作用。我们前期组学检测发现丹酚酸B影响组与正常对照组比较,mir-582-3p上调明显,且生物信息学分析发现mir-582-3p靶向调控NSUN5。我们前期研究发现NSUN5对BMSCs铁死亡有调控作用。因此我们推测,mir-582-3p靶向调控NSUN5可能是丹酚酸B抗BMSCs铁死亡,提高其移植后存活率的上游机制,而NSUN5可能是抗BMSCs铁死亡中关键的靶点。甲基化酶NSUN5是NSUN蛋白家族的重要成员,NSUN蛋白家族中多个成员均有潜在的m5C甲基转移酶功能结构域,部分酶在BMSCs铁死亡的过程中可发挥调控作用。而且mRNA m5C修饰在干细胞分化、铁离子代谢和应激反应等过程中均发挥重要作用,因此,我们推测NSUN5也可能通过mRNA m5C修饰某些铁蛋白或者通过招募相关基因而产生抗铁死亡作用。铁蛋白FTH1、FTL是我们机体最主要的铁储存仓,与铁死亡密切相关,RNA结合蛋白TRAP1则有抗ROS引起的细胞凋亡的作用,其变化可对铁死亡产生影响。因此,我们推测NSUN5很可能通过招募TRAP1对FTH1、FTL进行mRNA m5C甲基化修饰而产生抗铁死亡作用。综上,我们推测丹酚酸B可抗BMSCs铁死亡,从而提高BMSCs移植后存活率,其上游机制可能是通过mir-582-3p调控NSUN5抗BMSCs铁死亡,而下游机制则可能是NSUN5通过招募TRAP1对FTH1、FTL进行mRNA m5C甲基化修饰,起到抗BMSCs铁死亡作用。方法:1.表型验证方法构建铁死亡细胞模型,研究丹酚酸B是否抗BMSCs铁死亡。（1）构建BMSCs细胞铁死亡模型,通过流式细胞术、铁离子检测、活性氧ROS检测及脂质过氧化物检测验证模型构建成功。（2）BMSCs细胞内加入丹酚酸B,通过流式细胞实验、铁离子及ROS检测,WB实验及脂质过氧化物检测,从细胞层面验证丹酚酸B抗BMSCs铁死亡情况。2.上游机制研究方法通过组学研究分析及双荧光素酶报告基因等方法找到Mir-582-3p,并验证mir-582-3p调控NSUN5抗BMSCs铁死亡。通过芯片和生物信息学分析找靶基因和通路。（1）通过miRNA芯片技术分析丹酚酸B作用于BMSCs差异表达情况,找到感兴趣的差异表达基因;（2）采用生物信息学方法预测Mir-582-3p的靶基因;（3）采用生物学的GO富集性分析及KEGG通路分析Mir-582-3p相关功能及涉及的通路情况,分析其参与铁死亡的相关情况。实验验证靶基因表达及其靶向性及与铁死亡相关性。（1）使用BMSCs细胞Erastin诱导模型,通过RT-qPCR验证丹酚酸B作用后Mir-582-3p的表达差异;（2）通过铁离子检测、活性氧ROS检测、脂质过氧化物检测及Western blot法验证调节Mir-582-3p后BMSCs铁死亡和NSUN5靶蛋白表达情况;（3）采用双荧光素酶报告基因实验来验证mir-582-3p靶向NSUN5。3.下游机制研究方法通过免疫共沉淀等方法确定NSUN5通过招募TRAP1经由FTH1、FTL对其进行mRNA5m C甲基化修饰,起到抗BMSCs铁死亡作用。（1）使用BMSCs细胞Erastin诱导模型,通过RT-qPCR和western blotting筛选验证BMSCs中铁死亡差异表达的mRNAs和蛋白;（2）通过免疫荧光检测目标蛋白的表达信号及位置;（3）通过慢病毒载体过表达或敲低NSUN5,western blotting证实NSUN5在BMSCs细胞中的过表达或敲低;（4）在过表达或敲低NSUN5后,通过铁离子检测、活性氧ROS检测、脂质过氧化物检测及Western blot法检测BMSCs铁死亡情况,观察NSUN5对BMSCs细胞铁死亡的作用;（5）为了研究NSUN5抑制铁死亡的深层机制,通过RIP和RT-qPCR分析NSUN5在BMSCs中和FTH1、FTL的结合情况;（6）通过western blotting检测FTH1和FTL在调节NSUN5后的表达情况;（7）通过免疫荧光实验检测NSUN5、FTH1和FTL在BMSCs细胞质中共定位:（8）为了确定FTH1和FTL是否介导了NSUN5对BMSCs铁死亡的抑制作用,我们通过铁离子检测、活性氧ROS检测、脂质过氧化物检测过表达FTH1和FTL后铁死亡表型情况;（9）通过斑点杂交实验检测NSUN5基因敲低或者过表达后5m C水平;免疫荧光分析5m C表达水平;（10）为分析NSUN5介导的FTH1和FTL mRNA的5m C修饰的功能意义,我们通过RIP和RTqPCR检测分析抗5m C抗体富集FTH1和FTL mRNA情况及调节NSUN5后其水平变化;（11）通过使用FTH1和FTL特异性引物的亚硫酸氢盐测序评估了BMSCs中FTH1和FTL基因的甲基化状态;（12）通过测序结果序列分析,确定甲基化位点的C-to-T转化;（13）为确定是否还有其他蛋白参与NSUN5修饰FTH1和FTL的过程,通过质谱分析找到RNA结合蛋白TRAP1;（14）通过RIP分析抗NSUN5与TRAP1富集情况;（15）通过co-IP及western blotting证实TRAP1与FTH1或FTL之间的相互作用;（16）通过免疫荧光分析证实NSUN5和TRAP1蛋白共定位;（17）通过敲低NSUN5观察FTH1/FTL的表达量;（18）通过沉默NSUN5观察TRAP1 mRNA和蛋白水平。4.动物体内验证研究方法通过大鼠造模及免疫组化等方法,验证丹酚酸B抗BMSCs铁死亡并提高BMSCs移植后存活率及大鼠ALF治疗疗效的假说。（1）研究构建大鼠D–gal/LPS急性肝衰竭模型,肝功能等血清学检测观察大鼠TP、TBA、IRON2以及AMON等肝功能情况;（2）通过HE染色检测大鼠组织病理情况;（3）通过免疫组化检测大鼠组织NSUN5和FTH1/FTL表达情况。结果:1.表型验证发现,构建铁死亡Erastin诱导的细胞模型成功后,丹酚酸B可抗BMSCs细胞铁死亡。2.上游机制研究结果发现mir-582-3p调控NSUN5抗BMSCs铁死亡:通过miRNA芯片分析发现丹酚酸B作用于BMSCs的差异表达基因mir-582-3p,运用生物信息学方法预测该基因的靶基因发现mir-582-3p靶向NSUN5,GO及KEGG pathway分析发现,mir-582-3p靶向NSUN5可能与铁死亡相关。RT-qPCR验证丹酚酸B作用后Mir-582-3p的表达上调,Mir-582-3p调节NSUN5靶蛋白表达并影响铁死亡发生,双荧光素酶报告基因证明mir-582-3p靶向NSUN5。3.下游机制研究发现NSUN5通过招募TRAP1经由FTH1、FTL对其进行mRNA 5m C甲基化修饰,起到抗BMSCs铁死亡作用:（1）RT-qPCR和western blotting筛选验证发现BMSCs中NSUN5 mRNAs和蛋白表达下调;（2）免疫荧光检测发现目标蛋白NSUN5荧光信号弱于对照细胞;（3）慢病毒载体过表达或敲低NSUN5,通过western blotting证实NSUN5在BMSCs细胞中过表达或敲低;（4）在过表达或敲低NSUN5后,铁离子检测及Western blot法等检测发现NSUN5抑制BMSCs铁死亡;（5）为了研究NSUN5抑制铁死亡的深层机制,RIP和RTqPCR分析发现NSUN5在BMSCs中和FTH1、FTL结合;（6）western blotting检测发现NSUN5过表达增加了FTH1和FTL的表达水平;（7）免疫荧光实验检测发现NSUN5、FTH1和FTL在BMSCs细胞质中共定位:（8）为了确定FTH1和FTL是否介导了NSUN5对BMSCs铁死亡的抑制作用,通过铁离子等实验发现过表达FTH1和FTL后与模型组相比,总铁浓度的增加减少,ROS水平降低,脂质过氧化堆积减少;（9）斑点杂交实验发现NSUN5基因敲低可以降低5m C水平,而NSUN5过表达则相反;免疫荧光发现5m C表达水平结果同斑点杂交结果;（10）为分析NSUN5介导的FTH1和FTL mRNA的5m C修饰的功能意义,通过RIP和RT-qPCR检测发现抗5m C抗体富集FTH1和FTL mRNA,NSUN5沉默降低了这两个转录本中的5m C水平;（11）通过使用FTH1和FTL特异性引物的亚硫酸氢盐测序评估了BMSCs中FTH1和FTL基因的甲基化状态发现分别在5’（FTH1）和3’（FTL）非翻译区域（UTRs）发生甲基化;（12）通过测序结果序列分析,确定NSUN5下调降低了FTH1和FTL 5m C甲基化位点的C-to-T转化;（13）为确定是否还有其他蛋白参与NSUN5修饰FTH1和FTL的过程,质谱分析找到RNA结合蛋白TRAP1;（14）通过RIP发现抗NSUN5抗体富集TRAP1;（15）通过co-IP及western blotting证实TRAP1与FTH1或FTL之间的相互作用;（16）免疫荧光分析显示NSUN5和TRAP1蛋白共定位于BMSCs的细胞质中;（17）沉默NSUN5的表达,减少了TRAP1复合物中FTH1/FTL的沉淀量;（18）NSUN5敲除对TRAP1的蛋白或mRNA水平没有影响。4.动物体内验证研究发现丹酚酸B抗BMSCs铁死亡并提高BMSCs移植后存活率,及治疗ALF疗效,且其机制可能与NSUN5-FTH1/FTL通路相关:丹酚酸B联合BMSCs治疗大鼠ALF后,大鼠一般情况好转,死亡减少,肝脏外观瘀血明显减少,肝功能ALT、AST、TBIL以及血浆内毒素ET及TP、TBA、IRON2和AMON结果较模型组明显改善,HE染色检测发现大鼠组织紊乱也较模型组轻,表明丹酚酸B可以抗BMSCs铁死亡并提高BMSCs移植后治疗ALF疗效。免疫组化检测大鼠组织NSUN5和FTH1/FTL表达降低,提示其机制可能与NSUN5-FTH1/FTL通路相关。结论:丹酚酸B抗BMSCs铁死亡并提高BMSCs移植后存活率,提升BMSCs治疗ALF疗效,其上游机制是通过mir-582-3p靶向抑制NSUN5表达,抗BMSCs铁死亡,下游机制研究发现NSUN5通过招募TRAP1对FTH1和FTL进行mRNAs的5m C甲基化修饰抑制BMSCs铁死亡。实验动物研究发现,丹酚酸B抗BMSCs铁死亡并提高BMSCs移植后存活率,及治疗ALF疗效,且其机制可能与NSUN5-FTH1/FTL通路相关。主要结果如下:1.erastin诱导BMSCs铁死亡模型构建成功,中药丹酚酸B具有抗BMSCs铁死亡作用。2.通过芯片分析发现感兴趣的丹酚酸B作用于BMSCs的差异表达基因mir-582-3p,进一步生物信息学分析发现mir-582-3p靶向NSUN5。实验验证上游机制发现,mir-582-3p靶向NSUN5,且Mir-582-3p通过靶向NSUN5 3’UTR区抑制NSUN5。3.本研究中抗BMSC铁死亡下游机制是NSUN5通过招募TRAP1经由FTH1、FTL对其进行mRNA 5m C甲基化修饰,起到抗BMSCs铁死亡作用。4.丹酚酸B联合BMSCs细胞移植可提高治疗SD大鼠ALF疗效,其机制可能是通过NSUN5-FTH1/FTL通路发挥抗铁死亡,提高移植后BMSCs细胞存活率作用。