论文部分内容阅读
目的:腹泻型肠易激综合征（irritable bowel syndrome with predominant diarrhea,IBS-D）是一种临床上较为常见慢性功能性胃肠病,目前现代医学治疗缺乏特异性药物,临床实践过程中,发现肠安菌泰对肝郁脾虚型IBS-D有良好的的治疗效果,但其主要治疗机制和药效成分尚不清楚。本研究的主要目的:1.通过系统分析“肠安菌泰”的化学成分和入血成分,明确“肠安菌泰”潜在的有药效成分。2.运用网络药理学方法预测肠安菌泰治疗IBS的有效活性成分和潜在靶点。3.使用分子对接技术进一步筛选出药物-靶点-疾病网络中起关键作用的靶点和药物活性成分。4.通过母婴分离+束缚应激与醋酸灌肠+番泻叶灌胃复合造模建立肝郁脾虚型IBS-D大鼠模型,研究肠安菌泰治疗IBS-D的药效学。5.以网络药理学预测靶点为切入点探讨肠安菌泰治疗肝郁脾虚型IBS-D的潜在作用机制。方法:1.运用超高效液相色谱-四级杆-轨道阱高分辨质谱联用法（UHPLC-QE-MS）,对“肠安菌泰”入血成分进行鉴定。2.通过TCMSP、BATMAN-TCM数据库查找药物活性成分,通过Swisstargetprediction数据库获得化合物作用靶点,利用OMIN、Gene Cards、Dis Ge NET进行IBS疾病靶点预测,运用STRING数据库和Cytoscape软件完成分子网络架构,利用DAVID、KEGG、GO数据库完成富集分析,初步分析关键靶点和可能作用通路。3.将预测获得的潜在活性成分导入ZINC数据库获得单体结构图,从PDB数据库获得关键靶点蛋白的结构图,使用Autodock软件完成配体、受体的分子对接,利用PYMOL软件对结果进行可视化展示。4.通过母婴分离+束缚应激与醋酸灌肠+番泻叶灌胃复合造模建立肝郁脾虚型IBS-D大鼠模型,以糖水偏嗜实验、旷场试验、强迫游泳实验、避水应激实验、摄食量测定、大便含水率、腹壁回缩反射实验评价模型,确定成功建立肝郁脾虚型IBS-D大鼠模型。5.将SD大鼠分为8组,空白对照组（Control 10ml/kg/d生理盐水）、模型组（Model10ml/kg/d生理盐水）、肠安菌泰高剂量组（CAJT-H 3.4g/kg/d）、肠安菌泰中剂量组（CAJT-M 1.7g/kg/d）、肠安菌泰低剂量组（CAJT-L 0.85g/kg/d）、匹维溴铵组（Pinaveriumbromide 15mg/kg/d）、LY294002组（LY294002 0.75 mg/kg/d+10ml/kg/d生理盐水）、LY294002+肠安菌泰组（LY294002+CAJT 0.75mg/kg/d+CAJT 1.7g/kg/d）;药物干预2周,期间观察记录大鼠的一般情况、体重变化,干预结束后以糖水偏嗜实验、旷场试验、强迫游泳实验、避水应激实验、摄食量测定、大便含水率、腹壁回缩反射实验、结肠组织HE染色进行药效学评价。6.取大鼠结肠组织进行甲苯胺蓝染色法测定肥大细胞表达量,利用酶联免疫吸附试验测定大鼠血清组胺、白介素-8、β-氨基己糖苷酶的表达量,采用q PCR法和蛋白质印迹实验检测结肠组织和海马PI3K/AKT信号通路相关靶点的表达。结果:1.对“肠安菌泰”入血成分进行鉴定。鉴定出50种入血成分。2.运用网络药理学方法筛选出了肠安菌泰与IBS共同作用靶点94个,药物潜在活性成分36个,涉及基因功能主要有细胞增殖、细胞凋亡、信号转导等,涉及到的通路主要有癌症相关通路、PI3K-Akt信号通路、神经活动配体-受体关联通路、钙离子通路等。3.分子对接结果显示,网络药理学筛选出的化合物共34个可与PI3K受体蛋白结合,末端氨基酸形成氢键作用;36个化合物均可与AKT受体蛋白结合,末端氨基酸形成氢键作用。4.复合造模建立肝郁脾虚型IBS-D大鼠模型后与空白对照组相比:大鼠一般情况:精神状态、活动情况、毛发、进食量、大便情况等均变差。体重增加明显减少（P<0.05）;存在类似抑郁和焦虑的异常状态:旷场试验水平运动无差异,垂直运动减少（P<0.05）;糖水偏嗜明显下降（P<0.05）,避水应激期间大便次数增多（P<0.05）;强迫游泳实验漂浮时间延长（P<0.05）。肠黏膜通透性和内脏高敏增加:大便含水率增加（P<0.05）;腹部回缩反射注水量降低（P<0.05）。结肠HE染色未见明显病理学改变。5.各浓度中药组大鼠与模型组比较:一般情况:精神状态、活动情况、毛发、进食量、大便情况等均有所好转;体重增加较多,（P<0.05）;类似抑郁和焦虑的异常状态有所改善:旷场试验水平运动增加,垂直运动增加（P<0.05）;糖水偏嗜明显上升（P<0.05）,避水应激期间大便次数减少（P<0.05）;强迫游泳实验漂浮时间缩短（P<0.05）。肠黏膜通透性和内脏高敏降低:大便含水率减少（P<0.05）;腹部回缩反射注水量增加（P<0.05）。6.经过肠安菌泰治疗后,大鼠肥大细胞甲苯胺蓝染色数量明显减少（P<0.001）。高剂量肠安菌泰可以降低结肠组织PI3K、AKT、m TOR、BDNF、Trk B m RNA表达量（P<0.05）;中剂量肠安菌泰降低结肠组织PI3K、m TOR、Trk B m RNA表达量（P<0.05）,AKT、BDNF、m RNA表达量无统计学差异（P>0.05）;低剂量肠安菌泰降低结肠组织PI3K、AKT、Trk B m RNA表达量（P<0.05）,m TOR、BDNF、m RNA表达量无统计学差异（P>0.05）。高剂量肠安菌泰提高海马PI3K、m TOR、BDNF、Trk B m RNA表达量（P<0.05）,AKTm RNA表达量无统计学差异（P>0.05）;。中剂量肠安菌泰提高海马PI3K、BDNF、Trk B m RNA表达量（P<0.05）,AKT、m TOR m RNA表达量无统计学差异（P>0.05）;低剂量肠安菌泰对海马PI3K、AKT、m TOR、BDNF、Trk B m RNA表达量无明显作用（P>0.05）。7.经过肠安菌泰治疗后,空白对照组、CAJT-H组、CAJT-M组、CAJT-L组、匹维溴铵组、LY294002组、LY294002+CAJT组大鼠结肠组织p-m TOR蛋白相对表达量降低（P<0.05）;各组的AKT蛋白表达没有统计学差异（P>0.05）,p-AKT蛋白相对表达量降低（P<0.05）;各组的PI3K蛋白表达没有统计学差异（P>0.05）,除CAJT-L组外,其余各组p-PI3K蛋白相对表达量均降低（P<0.05）。8.与模型组相比较:空白对照组、CAJT-H组、匹维溴铵组大鼠海马p-m TOR蛋白相对表达量升高（P<0.05）,CAJT-M组、CAJT-L组、LY294002组、LY294002+CAJT组p-m TOR蛋白相对表达量没有差异（P>0.05）。各组的AKT蛋白表达没有统计学差异;空白对照组、各中药组p-AKT蛋白相对表达量升高,CAJT-H组有统计学意义（P<0.05）,LY294002组、LY294002+CAJT组大鼠海马组织p-AKT蛋白相对表达量降低;各组的PI3K蛋白表达没有统计学差异;空白对照组、各中药组海马p-PI3K蛋白相对表达量增加,CAJT-H组、匹维溴铵组有统计学意义（P<0.05）,LY294002组、LY294002+CAJT组大鼠海马组织p-PI3K蛋白相对表达量减少,无统计学意义（P>0.05）。9.肠安菌泰能够降低大鼠血清组胺、β-氨基己糖苷酶、IL-8含量对表达量,且差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1.肠安菌泰可能通过小檗碱、山奈酚、柚皮素、白术内酯Ⅱ、汉黄芩素等活性成分治疗肝郁脾虚型IBS-D。2.母婴分离+束缚应激结合醋酸灌肠+番泻叶灌胃复合造模法,复制肝郁脾虚型IBS-D模型,与其临床表现符合。3.PI3K/AKT通路在肝郁脾虚型IBS-D的发生、发展及治疗中有着重要作用。4.肠安菌泰颗粒剂可能通过PI3K/AKT信号通路及其相关下游信号蛋白起到治疗肝郁脾虚型IBS-D的效果。