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目的:类风湿关节炎是一种以影响关节和软骨的慢性炎症为特征的自身免疫性疾病,可导致不同程度的关节疼痛、僵硬、肿胀和畸形,并可引起不同程度的残疾。目前治疗类风湿关节炎的主要目的是缓解疼痛和炎症,减少关节损伤和残疾,维持或改善身体机能,保证正常的生活质量。中国是中草药大国,中医药治疗类风湿关节炎历史悠久,治疗经验和策略丰富,使中医药在临床治疗类风湿关节炎中广泛应用。在“因地制宜”“辨证论治”理念的指导下,本实验室拟出了昆断益母方这一临床使用有效的复方。实验室前期的研究已经证实昆断益母方对类风湿性关节炎有很好的疗效。作为一名越南医生,已将昆断益母方在越南进行推广,并取得一定的临床成果。但是其治疗类风湿关节的作用机制仍然大量未知。近年来,随着人们对类风湿性关节炎发病机制认识的不断深入,发现辅助性T17细胞（T helper 17,Th17）与调节性T细胞（regulatory T,Treg）之间的功能失衡是引起类风湿性关节炎发病的发病机制之一。因此,本研究利用小鼠类风湿性关节炎的动物模型-胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis,CIA）和体外细胞实验探讨昆断益母方对CIA小鼠和细胞内Th17/Treg失衡、炎症因子以及micro RNAs表达水平调控的作用,为昆断益母方类治疗类风湿性关节炎的作用机制提供新的理论依据。方法:（1）24只SPF级9周龄雄性DBA/1小鼠,采用随机数字表法将小鼠随机分为4组:正常组（Normal）、模型组（Model）、甲氨蝶呤组（MTX）和昆断益母方组（KDYMF）。以正常小鼠作为正常组,以MTX为阳性对照组,确保每组样本量为6只。采用牛II型胶原（collagen II,CII）免疫小鼠,诱导发生关节炎。自初次免疫后第21天（即第二次加强免疫当天,也就是造模完成当天）开始,给予相应的处理,昆断益母方（KDYMF）（0.2 m L/10g）,每天灌胃1次,连续2周;甲氨蝶呤（MTX）组,给予2 mg/kg,每周灌胃2次,连续2周;正常对照组给予等体积生理盐水,每天灌胃1次,连续2周后。每2天观察四肢临床评分,第35天予小鼠脱颈椎处死。在第35天取小鼠血液、脾脏、关节滑膜及软骨组织。HE染色检测踝关节组织病理学改变。（2）采用RT-qPCR方法检测第35天时外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）和关节滑膜组织中Treg细胞的特异性转录因子-特异性转录因子叉头蛋白p3（forkhead box p3,Foxp3）和Th17细胞的特异性转录因子-维甲酸相关孤儿受体γt（retinoid-related orphan nuclear receptor,RORγt）的m RNA表达水平;血清、关节滑膜组织和关节软骨组织中的Toll样受体4（Toll-like receptors 4,TLR4）和信号传导及转录激活因子3（signal transducers and activators of transcription,STAT3）m RNA表达水平;血清和关节滑膜组织中miR-21-5p表达水平。ELISA方法测定第35天时PBMC中白介素（interleukin,IL）-1β（IL-1β）、IL-17、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、IL-10的表达水平。（3）分离小鼠脾脏初始T细胞,置于IL-6（30 ng/m L）的极化环境进行培养,然后对细胞进行昆断益母方（KDYMF,600μg/m L）干预,实验分为4组,分别为对照组（Control）、昆断益母方组（KDYMF）、IL-6组（IL-6）、IL-6+昆断益母方组（IL-6+KDYMF）。培养48h后,RT-q PCR检测各组细胞中IL-17,IL-1β,TNF-α,IL-10的表达。随后对各组细胞给予anti-CD4抗体（2μg/m L）和anti-CD25抗体（2μg/m L）激活,流式细胞仪检测分析Th17和Treg细胞的比例。（4）小鼠原始T细胞,添加IL-6（30 ng/m L）同小鼠成纤维细胞样滑膜细胞同时极化培养,然后对细胞进行昆断益母方（KDYMF,600μg/m L）干预,实验分为4组,初始T细胞+滑膜细胞组（Control）,初始T细胞+滑膜细胞+昆断益母方组（KDYMF）、初始T细胞+IL-6+滑膜细胞组（IL-6）、初始T细胞+IL-6+滑膜细胞组+昆断益母方组（IL-6+KDYMF）,培养48h后,CCK8方法检测滑膜细胞的增殖;培养48h后,Transwell检测滑膜细胞迁移和侵袭;RT-q PCR检测各组滑膜细胞中miR-21-5p表达水平,以及Foxp3和RORγt的m RNA表达水平。结果:（1）从第25天开始,模型组（Model组）小鼠双侧的踝关节出现明显的类风湿性关节炎临床症状,在第35天时大部分小鼠表现踝关节强直样改变。甲氨蝶呤灌胃治疗（MTX组）和经过昆断益母方灌胃的治疗（KDYMF组）小鼠踝关节并没有出现明显的红肿,并且关节活动度也与正常小鼠无明显差异。（2）CIA小鼠踝关节组织HE染色病理结果显示,模型组小鼠踝关节结构破坏严重,炎症细胞浸润明显,滑膜增生,导致软骨及骨破坏。DTYMD组及MTX组踝关节相对完整,滑膜增厚不明显,少量炎症细胞浸润。（3）CIA小鼠在免疫的第35天时,与Model组相比,MTX组和KDYMF组小鼠的血液PBMC和关节滑膜组织中Foxp3的m RNA相对表达水平均表现上调,但在KDYMF组小鼠中更显著;而MTX组和KDYMF组小鼠的血液PBMC和关节滑膜组织中RORγt的m RNA相对表达水平均表现下调,在KDYMF组小鼠中更显著。（4）CIA小鼠在免疫的第35天时,与Model组相比,MTX组小鼠的血液PBMC中IL-1β、IL-17、TNF-α表达水平均表现上调,但IL-10表达水平表现出显著下调;KDYMF组小鼠的血液PBMC中IL-1β、IL-17、TNF-α表达水平均低于MTX组,更接近Normal组表达水平;而IL-10表达水平高于MTX组,更接近Normal组表达水平。（5）CIA小鼠在免疫的第35天时,与Model组相比,MTX组和KDYMF组小鼠的血清和关节滑膜组织中miR-21-5p相对表达水平均表现上调,但在KDYMF组小鼠中更显著。（6）CIA小鼠在免疫的第35天时,与Model组相比,MTX组和KDYMF组小鼠的血清、关节滑膜组织和关节软骨组织中TLR4和STAT3的m RNA相对表达水平均表现下调,但在KDYMF组小鼠中更显著,更接近Normal组表达水平。（7）昆断益母方能抑制初始T细胞中炎症因子IL-17、IL-1β和TNF-α表达,但促进IL-10表达。IL-6刺激能促进初始T细胞中炎症因子IL-17、IL-1β和TNF-α表达,但抑制IL-10表达;昆断益母方能降低经IL-6刺激能促进初始T细胞中炎症因子IL-17、IL-1β和TNF-α表达,而上调IL-10表达。（8）昆断益母方能上调初始T细胞分化出来的Treg细胞比例,降低Th17细胞比例。IL-6刺激会明显增加Th17细胞数目,降低Treg细胞数目;但是昆断益母方药能增加Treg细胞比例,下调Th17细胞比例,使Treg细胞和Th17细胞更接近正常水平。（9）昆断益母方能明显抑制正常条件下类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的增殖、迁移和侵袭,同时也能明显抑制T细胞经IL-6刺激后与类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞共培养后细胞的增殖、迁移和侵袭。（10）昆断益母方能明显促进正常条件下类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中miR-21-5p和Foxp3的m RNA的相对表达,降低RORγt的m RNA相对表达水平。同时也能明显上调T细胞经IL-6刺激后与类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞共培养后细胞中miR-21-5p和Foxp3的m RNA的相对表达,降低RORγt的m RNA相对表达水平。结论:（1）CIA模型小鼠体内存在Th17/Treg细胞功能失衡。（2）从CIA小鼠模型和体外细胞模型证实了昆断益母方能够显著提高血清或细胞中IL-10水平,下调IL-1β、IL-17和TNF-α炎症因子水平。（3）从CIA小鼠模型和体外细胞模型证实了昆断益母方能够显著抑制Th17细胞分化,促进Treg细胞生成,改善Treg/Th17失衡状态。（4）昆断益母方能够抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的增殖、迁移和侵袭。（5）昆断益母方能够促进细胞内miR-21-5p的相对表达水平。