卵巢储备功能减退（DOR）是指女性卵巢内可募集卵母细胞数量减少,并见质量下降的一种病理状态,目前尚无明确有效的治疗方式。本课题组前期临床研究中发现,麒麟丸可提高脾肾两虚、冲血不足型DOR患者的抗米勒管激素（AMH）水平,改善患者月经情况及脾肾两虚的中医证候,但相关基础研究欠缺,其作用机制亟待阐明。目的:1.研究麒麟丸及其主要成分之一金丝桃苷,对DOR小鼠卵巢功能及生育力的影响及作用机制。2.研究金丝桃苷对受损颗粒细胞增殖、凋亡、线粒体膜电位、自噬及缺氧的影响。方法:1.动物实验:基于缺氧相关性自噬研究麒麟丸、金丝桃苷对DOR小鼠的卵巢功能及生育力的影响共选用SPF级雌性C57BL/6小鼠48只,随机分为空白组、模型组、金丝桃苷组和麒麟丸组,每组各12只。麒麟丸组灌胃麒麟丸溶液5.46 g·kg-1·d-1,金丝桃苷组灌胃金丝桃苷溶液40mg·kg-1·d-1,其余两组灌胃等体积0.5%CMC-Na溶液,连续5周。给药干预一周后,模型组、金丝桃苷组、麒麟丸组腹腔注射环磷酰胺溶液75mg·kg-1,空白组注射等体积氯化钠注射液,1次/周,共4次。给药期间监测小鼠体质量及动情周期,给药结束后,每组随机挑选6只小鼠处死取材。记录小鼠卵巢湿重,ELISA法检测小鼠血清AMH水平、促卵泡生成素（FSH）、雌二醇（E2）水平,HE法观察卵巢组织结构,并统计各级卵泡数,RT-qPCR法和Western Blot法分别检测卵巢LC3B、P62、HIF-1α、Bnip3、Beclin1 mRNA和蛋白水平,免疫组化法检测小鼠卵巢内LC3B及HIF-1α阳性表达定位。其余每组6只小鼠正常饲养7周,再与生育能力正常的SPF级雄性C57BL/6小鼠以2:1比例合笼4周,记录受孕所需时间、受孕总数、吸收胎数及正常仔鼠数。2.细胞实验:金丝桃苷对受损颗粒细胞增殖、凋亡、缺氧及自噬的影响（1）不同浓度4-HC对KGN细胞增殖、缺氧及自噬的影响分别以2μM、4μM、8μM、16μM 4-HC干预KGN细胞6h、12h、24h、48h,CCK-8法检测各组细胞增殖水平;以2μM、4μM、8μM浓度4-HC干预KGN细胞24h,Western Blot检测LC3B-Ⅱ、P62及HIF-1α蛋白水平变化趋势;（2）不同浓度金丝桃苷对KGN细胞增殖的影响分别以0.1μM、1μM、10μM、100μM、1m M金丝桃苷干预KGN细胞24h,采用CCK-8检测各组细胞增殖情况。（3）不同浓度金丝桃苷对受损KGN细胞增殖、凋亡的影响以8μM浓度4-HC干预KGN细胞24h后,分别以0.1μM、1μM、10μM、100μM金丝桃苷加药作用24h,用CCK-8法检测细胞增殖情况,Hoechst染色观察细胞凋亡水平。（4）金丝桃苷对受损KGN细胞缺氧及自噬的影响分别以DMSO、4-HC、金丝桃苷、4-HC+金丝桃苷干预KGN细胞24h后,Western Blot法检测各组细胞LC3B、P62、HIF-1α、Bnip3、Beclin1蛋白表达水平,JC-1染色法检测线粒体膜电位变化;以mCherry-GFP-LC3质粒转染KGN细胞后,分别以DMSO、4-HC、金丝桃苷、4-HC+金丝桃苷加药干预24h,共聚焦显微镜下观察细胞自噬流变化。结果:1.动物实验（1）小鼠一般情况变化模型组小鼠出现被毛无光泽、蜷缩背弓现象,活动量减少,时有大便溏薄;金丝桃苷组及麒麟丸组小鼠精神状态、行为活动较模型组改善,大小便正常。（2）小鼠动情周期变化自环磷酰胺给药第一周,模型组小鼠动情间期延长,直至停滞于动情间期。金丝桃苷组及麒麟丸组自环磷酰胺给药后第二周出现动情周期紊乱,动情间期比例增加,但始终存在动情期表现。（3）小鼠体质量变化与空白组比较:D13、D17、D21、D25,模型组小鼠体重显著降低（P<0.05或P<0.01）;D13、D25、D33,金丝桃苷小鼠体重降低（P<0.05或P<0.01）;D13、D19、D21、D23、D25、D27、D31、D33、D35,麒麟丸组小鼠体重显著降低（P<0.05或P<0.01）。（4）小鼠卵巢指数比较与空白组比较,模型组、金丝桃苷组、麒麟丸组小鼠卵巢指数均显著降低（P<0.01）。与模型组比较:金丝桃苷组及麒麟丸组小鼠卵巢指数升高（P<0.05）。（5）小鼠血清AMH、FSH、E2水平比较与空白组比较,模型组、金丝桃苷组、麒麟丸组小鼠AMH水平均下降（P<0.01,P<0.01,P<0.05）,模型组、金丝桃苷组FSH水平显著升高（P<0.01,P<0.05）。与模型组比较:金丝桃苷组FSH、AMH、E2水平均未见统计学差异（P>0.05）;麒麟丸组小鼠AMH升高（P<0.05）,FSH与E2水平无明显变化（P>0.05）。（6）小鼠各级卵泡数及比例比较与空白组比较:模型组小鼠始基卵泡数、初级卵泡数、次级卵泡数减少（P<0.01,P<0.05,P<0.01）,闭锁卵泡数及比例显著增加（P<0.05或P<0.01）。与模型组比较:金丝桃苷组小鼠始基卵泡数增加（P<0.01）,闭锁卵泡数及比例下降（P<0.05,P<0.01）;麒麟丸组小鼠始基卵泡数显著增加（P<0.01）,闭锁卵泡数减少（P<0.01）,发育中卵泡和闭锁卵泡比例下降（P<0.05,P<0.01）。（7）小鼠生育力比较与空白组比较:模型组小鼠受孕时间延长（P<0.05）,吸收胎数量增加（P<0.05）;与模型组比较:金丝桃苷组和麒麟丸组小鼠受孕时间均缩短（P<0.05）,金丝桃组小鼠吸收胎数量减少（P<0.05）,麒麟丸组小鼠吸收胎数量无显著变化（P>0.05）,各组小鼠受孕总数及健康仔鼠数无显著差异（P>0.05）。（8）小鼠卵巢自噬水平比较与空白组比较,模型组小鼠LC3B蛋白及mRNA水平显著升高（P<0.01）,P62蛋白水平降低（P<0.01）。与模型组比较:金丝桃苷组小鼠LC3B mRNA及蛋白水平降低（P<0.01,P<0.05）,P62蛋白升高（P<0.01）;麒麟丸组小鼠LC3B mRNA及蛋白水平显著降低（P<0.01）,P62 mRNA及蛋白水平升高（P<0.05）。（9）小鼠卵巢内HIF-1α/Bnip3/Beclin1通路表达水平比较与空白组比较:模型组小鼠卵巢Bnip3、Beclin1 mRNA及蛋白水平均显著升高（P<0.01）,HIF-1α蛋白表达显著增加（P<0.01）。与模型组比较,金丝桃苷组及麒麟丸组小鼠Bnip3 mRNA及蛋白均降低（P<0.01）,麒麟丸组Beclin1mRNA表达降低（P<0.05）。各组间HIF-1αmRNA水平无显著差异（P>0.05）。2.细胞实验（1）4-HC对KGN细胞增殖具有显著的抑制作用,并呈现时间、浓度依赖性,8μM4-HC作用KGN细胞24h时可达到约50%细胞抑制率。8μM 4-HC可显著上调KGN细胞内LC3B-Ⅱ、HIF-1α蛋白水平、降低P62蛋白水平（P<0.05,P<0.05,P<0.01）,并呈现浓度依赖性。（2）1μM、10μM金丝桃苷可显著促进KGN细胞增殖（P<0.01）;1m M金丝桃苷可显著抑制KGN细胞增殖（P<0.01）。（3）与4-HC组比较:当金丝桃苷浓度为10μM时可显著促进受损颗粒细胞的增殖（P<0.01）。Hoechst染色发现,4-HC可诱导KGN细胞凋亡发生。10μM金丝桃苷可显著抑制受损KGN细胞凋亡。（4）与DMSO组比较:4-HC组细胞LC3B-Ⅱ、HIF-1α、Bnip3、Beclin1蛋白表达增加（P<0.05或P<0.01）,P62蛋白表达抑制（P<0.01）。与4-HC组比较:4-HC+金丝桃苷组细胞LC3B-Ⅱ、HIF-1α、Bnip3及Beclin1蛋白水平降低,P62蛋白水平显著增加（均为P<0.01）,提示金丝桃苷抑制了4-HC诱导的缺氧和自噬激活。（5）JC-1染色发现:与DMSO组比较:4-HC组细胞线粒体膜电位显著降低;与4-HC组比较:4-HC+金丝桃苷组细胞线粒体膜电位水平有所恢复。（6）mCherry-GFP-LC3转染后发现:4-HC组细胞内出现明显的光斑聚集,以红色荧光为主,提示自噬激活且通畅;4-HC+金丝桃苷组内见散在少量自噬光斑,红色荧光和绿色荧光强度相似,提示金丝桃苷显著抑制了4-HC诱导的自噬流过度活化。结论1.环磷酰胺可降低小鼠卵巢储备功能及生育力,是诱导DOR小鼠模型的有效手段;2.环磷酰胺诱导的DOR小鼠卵巢内存在自噬及缺氧过度激活,提示缺氧及自噬可能在DOR发生中发挥重要作用,有望成为DOR治疗的关键靶点;3.麒麟丸及金丝桃苷可能是通过抑制小鼠卵巢内过度激活的自噬及缺氧,恢复DOR模型小鼠卵巢储备功能及生育力;4.金丝桃苷可促进受损颗粒细胞细胞增殖,恢复线粒体膜电位,抑制细胞凋亡,逆转颗粒细胞缺氧及自噬过度激活状态,保护颗粒细胞免受化疗药物诱导的细胞损伤。