枣果实类黄酮含量动态变化及相关基因的功能研究

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枣(Ziziphus jujuba Mill.)是鼠李科的经济林果,我国枣产量占世界的90%以上。枣果实中富含类黄酮并因其功能而倍受关注。为此,论文主要对枣果实成熟过程中类黄酮含量及相关调控基因表达差异进行研究,并验证关键基因黄酮醇合成酶功能,为枣果实功能成分的深度开发和综合利用提供依据。取得主要结论如下:1.类黄酮在枣果实成熟过程中的动态变化。‘稷山板枣’和‘骏枣’成熟过程中,总黄酮和总黄烷醇含量从白熟期到完熟期呈现持续下降趋势,但干枣时含量有所增加,且在果皮中含量高于果肉,‘稷山板枣’含量高于‘骏枣’。高效液相色谱技术在‘稷山板枣’和‘骏枣’果皮和果肉中检测到4种黄烷醇和5种黄酮醇。黄烷醇类物质有儿茶素、表儿茶素、原花青素B1和原花青素B2,槲皮素及其糖苷类衍生物则是主要的黄酮醇类物质。果皮中四种黄烷醇随果实成熟含量不断下降,槲皮素及其糖苷类物质在两个枣品种中从白熟期到完熟期整体上也呈下降趋势,但部分物质在半红或全红时含量有所增加。果肉中类黄酮组分含量均低于果皮,白熟期开始逐渐下降,干枣阶段含量增加。2.类黄酮合成相关基因的表达分析。q RT-PCR分析发现,类黄酮合成相关基因在两种枣果皮中表达量的变化趋势基本相同,从白熟期到完熟期呈下调趋势,但两个品种及不同成熟时期表达有所差异。相关性分析表明,下游基因(F3H、F3’H、FLS、ANR、LAR、UFGT)与类黄酮及其组分含量呈显著或极显著相关。3.枣黄酮醇合成酶的功能研究。克隆得到Zj FLS1和Zj FLS2基因序列,与其他物种FLS进化关系较近,编码的氨基酸与其它物种具有较高的同源性。利用q RT-PCR分析发现,Zj FLS1和Zj FLS2在两个枣品种不同组织及不同成熟阶段均有表达,且具有组织差异性,在花和幼叶中的表达量较高,成熟过程中表达模式和黄酮醇含量变化趋势一致。相关性分析表明,两个FLS基因的表达和黄酮醇含量呈正相关。通过构建亚细胞定位融合表达载体p CAMBIA2300-Zj FLS1-GFP和p CAMBIA2300-Zj FLS2-GFP,并导入到烟草叶片中发现,Zj FLS1和Zj FLS2不仅在细胞核上表达,而且在细胞质和内质网上均有表达。进一步功能验证,Zj FLS1和Zj FLS2原核表达,获得重组融合蛋白的分子量约40k Da。二氢黄酮醇为底物进行体外酶活试验,HPLC结果显示,Zj FLS1和Zj FLS2均能催化二氢槲皮素形成槲皮素,说明具有催化活性。该研究系统阐明了枣果实类黄酮成分的积累及其分子机制,为红枣(干枣)功能成分开发利用提供了基础。
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