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目的:血管新生(angiogenesis)在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。在肿瘤形成早期,肿瘤直径超过2-3mm时,就必须生成血管来维持氧气和营养物质的输送。肿瘤的血管表现为孔隙多,表面粗糙,细胞间连接松散,使得肿瘤血管通透性增强,有利于肿瘤细胞的血道转移,且在肿瘤周围形成特殊的微环境。目前,抑制肿瘤血管新生的靶向药物被成功研发并广泛应用于临床,并取得较好的治疗效果。但是也出现了药物副反应、药效低、耐药等一系列问题。因此,探寻其他潜在的可作为抗肿瘤血管新生治疗靶点的分子就显得尤为重要。RNA编辑(RNA editing)是一种重要的转录后调节机制,发生A到I的RNA编辑的抗酶抑制因子1(antizyme inhibitor1,AZIN1)参与调控肿瘤发生发展的多种生物学行为。本文拟通过体内外实验阐明RNA编辑型AZIN1在肿瘤血管新生中的作用和机制。研究方法:1、采用Real-time PCR检测结直肠癌细胞系中AZIN1的表达。2、构建质粒,包装慢病毒,用慢病毒感染HCT 116和HT-29细胞,构建稳定转染野生型和编辑型AZIN1及对照的HCT 116和HT-29细胞系,用嘌呤霉素筛选并维持。3、Western blot和Real-time PCR分别检测稳转细胞系中AZIN1蛋白和mRNA的表达。4、提取对照组与野生型、编辑型组细胞的条件培养基(conditional medium,CM),与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行共培养。5、采用CCK-8法检测各组CM对HUVEC增殖的影响。6、采用划痕实验(Wound healing)和transwell实验检测各组CM对HUVEC迁移能力的影响。7、利用成管实验(tube formation),比较各组CM对HUVEC成管能力的影响。8、采用裸鼠移植瘤模型,每组十只,在裸鼠左侧接种6×10~5 HUVEC和3×10~6 HCT 116的细胞混悬液共100ul,右侧只接种3×10~6HCT 116细胞混悬液100ul,每周测量两次肿瘤体积。9、采用Micro-CT扫描检测每只裸鼠肿瘤内血管分布情况。10、Human angiogenesis Array实验检测野生型和编辑型组细胞CM中调控血管生成因子的表达,ELISA实验检测各组CM中Pigment epithelium-derived factor(PEDF)和Platelet derived growth factor(PDGF-AA)的表达量。11、非靶向代谢组学(metabolomic)检测各组CM中代谢物的差异。12、向HUVEC中加入梯度浓度的乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC),CCK-8检测NAC对HUVEC增殖的影响,transwell和划痕实验检测NAC对HUVEC迁移能力的影响,成管实验检测NAC对HUVEC成管能力的影响。结果:1、RNA编辑型AZIN1组的细胞条件培养基明显促进HUVEC迁移和血管形成,对HUVEC增殖能力无明显影响。2、RNA编辑型AZIN1组的裸鼠移植瘤体积明显高于对照组和野生型组,血管内皮细胞共培养移植瘤体积明显高于单独接种组。3、RNA编辑型AZIN1组的裸鼠移植瘤内血管密度明显高于野生型和对照组。4、RNA编辑型AZIN1组的细胞CM中PEDF显著低于对照组和野生型,PDGF-AA未见明显差异。5、RNA编辑型AZIN1组的细胞CM中NAC含量高于对照组和野生型组,外源加入NAC对HUVEC的影响呈现剂量依赖,高浓度NAC显著抑制HUVEC的生物学行为,低浓度NAC促进HUVEC的迁移成管能力,对增殖无明显影响。结论:RNA编辑型AZIN1促进血管内皮的迁移成管能力,可能通过上调NAC的表达和抑制PEDF的表达,来促进肿瘤血管生成。