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目的:(1)观察热休克蛋白47(HSP47)对人胚肺成纤维细胞(HELF)胶原合成及间质细胞标志物的影响,探讨它与肺纤维化的关系。(2)分析在HELF中,HSP47与转化生长因子-β1(TGF-β1)之间的关系。(3)沉默HSP47(siRNA)对肺纤维化的影响。
方法:(1)用TGF-β1诱导HELF表达HSP47,观察用5ng／mLTGF—β1作用不同时间和用不同浓度TGF-β1作用于HELF48h；WST法检测TGF-β1对HELF增殖影响；细胞免疫荧光法检测HSP47的表达；免疫印迹技术检测HSP47、Ⅰ型胶原(Collagen-Ⅰ)及间质细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)的表达。(2)培养HELF分为四组:空白对照组、热休克组、TGF组及热休克+TGF组。免疫印记法分别检测各组HSP47、Collagen—Ⅰ、α-SMA、Vimentin表达情况。(3)用TGF-β1预处理HELF48h后,分成3组:正常组,无基因转染入细胞内；对照组,带有免疫荧光的无义基因片段采用脂质体RNAiMAX Reagent将其转染入细胞内；干扰组,针对HSP47设计合成3条干扰片段siRNA1,2,3,采用脂质体RNAiMAX Reagent将其转染入细胞内,PCR法检测HSP47的mRNA水平；蛋白质印迹法检测HSP47与Collagen-Ⅰ的表达水平。(4)统计学处理采用SPSS16.0软件进行统计学处理。
结果:(1)正常HELF表达少量HSP47,随着HELF在TGF-β1作用时间的延长和剂量逐渐增加,HSP47、Collagen—Ⅰ、α—SMA和Vimentin的表达均同步增强(P<0.05)。TGF-β1能促进HELF的增殖(P<0.05)。(2)HSP47、Collagen-Ⅰ、α-SMA、Vimentin在TGF-β1作用下表达明显上调,在TGF-β1+热休克反应的作用下上调更明显,而单在热休克反应组中HSP47表达显著,Collagen-Ⅰ却未见明显增强(P<0.05)。(3)siRNA干扰HELF的HSP47 mRNA表达水平显著低于正常组与对照组,差异有统计学意义(P<0.05),而正常组与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。干扰组HSP47、Collagen-Ⅰ及α-SMA的表达水平也显著低于正常组及对照组,而正常组与对照组相差异无统计学意义(P>0.05)。
结论:(1)HSP47在TGF-β1的作用下表达上调,促进HELF胶原蛋白的合成,作为胶原特异性分子伴侣在肺纤维化的发生发展过程中发挥至关重要的作用。(2)HSP47很有可能为TGF-β1的一个下游细胞因子,受TGF-β1的调节,在肺纤维化中起着重要的作用。(3)HSP47siRNA可以抑制HELF中HSP47与其蛋白的表达,同时抑制了Collagen-Ⅰ及α-SMA的表达。