目的以未经过免疫的、天然的纳米抗体为原材料,以噬菌体展示技术为基础,构建纳米抗体展示库,并验证展示库的各项指标是否符合进一步筛选的需求,以实现利用抗原靶向筛选相应纳米抗体的目的。以CD19为抗原筛选纳米抗体,对其进行表达和纯化并对其抗体结合能力进行验证。方法提取双峰驼的脾脏组织总RNA,并使用Oligo DT反转录获得c DNA,以c DNA片段为模板进行巢式PCR,通过两步PCR获得其重链可变区片段并进行噬菌体展示文库的构建。选择p CANTABA5e噬菌粒,使用限制性内切酶对噬菌粒进行双酶切,作为噬菌体展示的载体,同样对巢式PCR获得的重链可变区片段进行双酶切,使用DNA连接酶连接酶切后噬菌粒载体和重链可变区片段。电转化至TG1大肠杆菌中并对其进行KM13辅助噬菌体救援以构建噬菌体展示库,并对其库容及多样性进行分析和鉴定。以CD19为抗原进行纳米抗体的淘选,将生物素化的CD19抗原在液相中与链霉亲和素磁珠进行孵育,通过磁力架收集磁珠。反复洗涤磁珠后,对附着在磁珠上的噬菌体进行洗脱。培养TG1大肠杆菌并加入洗脱获得的噬菌体进行侵染,进一步培养后收集噬菌体以用于下一轮的筛选。重复淘筛过程三次,使富集表面表达有抗CD19的纳米抗体噬菌体单克隆。对淘筛后单克隆进行Phage-ELISA鉴定、测序、分析和验证。选取其中各项分析数据优的抗CD19纳米抗体进行表达和纯化。将目的纳米抗体序列连接人Ig G Fc段并连入载体p CZN1的Nde I和Xba I位点之间获得的重组质粒。将重组表达质粒转入Top10克隆菌株进行纳米抗体的原核表达和纯化,随后收获纯化后的抗CD19纳米抗体,并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western Blot验证目的蛋白。对目的蛋白进行抗原结合验证,以CD19为抗原,目的蛋白作为一抗,抗人Ig G/HRP作为二抗进行Weatern Blot验证。结果1.以噬菌体展示技术为基础,以未免疫的驼源纳米抗体为原材料,构建纳米抗体展示文库,展示库容量为1.0x1013CFU/ml。随机挑取20个克隆进行目的片段扩增验证及测序分析,结果显示其目的片段插入率约为95%。测序分析结果进行BLAST显示氨基酸同源性为65.85%,通过构建MEGA系统进化树显示所建展示文库多样性较好。2.以CD19为目标抗原经三轮噬菌体展示文库淘筛,在第三次淘筛后收获噬菌体单克隆,挑取单个克隆并扩大培养收获上清,进行Phage-ELISA鉴定,并选择酶联免疫吸附测定结果较高的多个单克隆进行基因测序分析。对测序结果进行BLAST分析结果显示均为驼源纳米抗体,多序列比对结果显示共筛选得到3条待验证的抗CD19纳米抗体,对3条序列进行亲水性分析结果显示亲水性良好。3.选择其中各项分析指标较好的序列进一步表达和验证。将序列连接人Ig G Fc段并与p CZN1质粒构建重组表达载体,转入Top10菌株进行蛋白表达,并在表达过程中加入IPTG,对表达产物进行SDS-PAGE结果显示为该重组蛋白为包涵体表达,进行包涵体变复性并重溶目标蛋白,经过镍柱纯化收获目标纳米抗体。利用抗His标签对重组蛋白进行Weatern Blot验证,结果显示目的蛋白分子量大小约为40Kda。随后对目的蛋白进行抗原结合验证,结果显示该目的抗体可以与抗原CD19进行结合。通过表面等离子共振技术纳米抗体与人CD19结合的亲和力为0.29μM。结论成功构建了滴度高、多样性好的驼源天然纳米抗体噬菌体展示库,以CD19为抗原进行淘筛获得三条抗CD19纳米抗体序列。对其中一条纳米抗体进行表达和验证,结果符合抗CD19纳米抗体特性,且淘筛获得的纳米抗体可与CD19结合。为研究以CD19为靶标的诊断试剂盒以及抗体药物提供技术支持,为制备靶向CD19的CAR-T细胞提供理论依据与技术支撑。