邻苯二甲酸酯降解酶的筛选及其在土壤修复中的应用

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邻苯二甲酸酯类化合物(Phthalate esters,PAEs)是一类典型的优控污染物,具有内分泌干扰、神经毒性、免疫毒性等多种危害,可通过食物链进入人体进而对人体健康造成严重威胁。在农业生产过程中,由于农用塑料地膜的大规模使用,农田土壤成为PAEs的重要汇集地,农田土壤的修复要求在去除土壤中污染物的同时,保持其生态功能。因此,研究一种农田土壤的绿色修复技术对促进农业绿色生产和降低人体健康风险具有重要意义。本论文以邻苯二甲酸酯PAEs作为目标污染物,通过对比5种常见商业酶对PAEs的降解情况,确定产自假丝酵母菌的脂肪酶为PAEs降解酶,在水体系中研究了脂肪酶对不同烷基链长PAEs的结构选择性并进行了PAEs降解产物的分析和降解途径的推断。开展了不同条件下脂肪酶对PAEs污染农田土壤的修复研究,探究了生物炭对游离态脂肪酶的固定化及固定化脂肪酶在农田土壤修复中的应用。本研究主要结论如下:(1)通过对比5种商业酶对PAEs的降解效果发现,在漆酶(有无氧化还原介体)、过氧化物酶和α-淀粉酶参与的反应中均未表现出明显的降解活性,而羧酸酯酶和脂肪酶则可有效降解系统中7种不同的PAEs,降解效率保持在88.14%~99.16%之间。(2)不同烷基链长的PAEs在脂肪酶催化反应体系中各时间点下所检测到的相对浓度表现出不同的降解趋势,在水体系中脂肪酶对7种PAEs的催化降解符合一级降解动力学(R2>0.97),随着PAEs烷基链的增长和分子量的增加,其降解速率会逐渐变慢。通过分析降解速率常数、半衰期和辛醇水分配系数(log Kow)的相关性可知,随着PAEs的log Kow增加,其水溶性降低,污染物质与酶的结合就越困难,降解速率就越慢。综合以上分析可知,水体系中脂肪酶对7种PAEs的结构选择性表现为,降解速率由大到小顺序:DMP>DEP>Di BP>Dn BP>DEHP>Dn OP>Dn NP。(3)在脂肪酶催化作用下PAEs首先通过酯键断裂水解为其对应单酯MPEs,再经一步水解生成产物PA。以此可知,直接通过酶作用于目标污染物的研究方法可获得相对于微生物降解更为清晰的污染物降解途径,这使得污染物的生物降解机理更为清晰化。(4)脂肪酶可以明显降解土壤中的PAEs,最优条件下的7种PAEs降解率保持在47.5%~73.9%。采用控制变量法对不同因素对修复过程的影响进行了分析,研究分析发现:脂肪酶浓度控制在2 U/g水平可保证修复工作有效且经济;土壤p H和温度是通过直接影响脂肪酶活性进而影响降解效果;土壤含水率保持在45%时,脂肪酶在土壤环境中的流动性受限制程度较小且降解速率较快;光照及土壤微生物对脂肪酶降解土壤中PAEs不具有显著影响(p>0.05)。通过对土壤体系中脂肪酶降解PAEs情况进行一级动力学方程的拟合,发现同水体系中脂肪酶对于不同PAEs的结构选择性相同,随着PAEs烷基链的增加,其降解效率会随之降低。此外,土壤中不同PAEs的降解速率常数均小于水体系下对应PAEs的速率常数,这主要是由反应体系中酶分子和目标污染物的流动性决定的。(5)分别研究了不同因素对固定化脂肪酶的酶活性回收率的影响,结果显示,当固定化条件为4 U/m L的脂肪酶浓度、生物炭粒径为40目、固定化反应时间为5 h时,固定化脂肪酶的酶活性回收率可以达到68%~73%,且其热稳定和酸碱稳定性均优于游离态脂肪酶。通过比较游离态脂肪酶及固定化脂肪酶对土壤中PAEs的作用影响发现,在相同酶浓度水平下培养168 h,游离态脂肪酶体系中PAEs的降解效率在42.1%~72.3%的范围内,而固定化脂肪酶体系中的PAEs降解效率为46.8%~76.8%,固定化脂肪酶表现出了比游离态脂肪酶更为持久有效的降解效果。因此,以生物炭为载体的固定化脂肪酶在PAEs污染的农田土壤中的应用具有较强的优势和可实践价值。
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