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背景糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）是糖尿病重要的微血管并发症之一,被认为是终末期肾脏病常见的病因。然而糖尿病并发肾损伤的患者并非全部为糖尿病肾病,这部分患者为非糖尿病肾病（Non-Diabetic Renal Diseases,NDRD）,两类疾病的治疗方案及临床预后存在着很大的差别,非糖尿病肾病包括糖尿病合并膜性肾病（Membranous Nephropathy,MN）、糖尿病合并IgA肾病（IgA Nehropathy,IgAN）等。目前临床上两类疾病的诊断与病情的监测主要依靠肾脏穿刺活检和尿微量白蛋白的检测。但是肾脏穿刺活检是侵入性操作,尿微量白蛋白并不完全和病情严重程度相关。miRNA是一种长度约为22nt的非编码RNA,参与多个基因的转录后调控,在多种在多种生理和病理过程均起关键作用,包括糖尿病肾脏疾病在内的多种肾脏病。而尿沉渣中miRNA,有望成为鉴别DN和NDRD,以及临床治疗效果连续监测的有前途的无创生物标志物。目的本研究拟利用miRNA芯片寻找各筛选队列组间表达水平有明显差异的miRNAs,结合生物信息学技术,筛选出DN特异性miRNA标志物,继而扩大验证样本量进行实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR）验证,对芯片结果进行验证并筛选出数种DN特异性的miRNAs生物标志物,评估这些miRNAs在DN诊断及病情判断中的作用。进一步分析上述尿沉渣miRNAs标志物与临床指标的相关性,为DN无创诊断生物标志物的发现提供一定指导意义。方法1.收集2016年1月-2018年1月在中国人民解放军总医院住院有糖尿病病史且经肾脏活检确诊的病理分型为DN、IgAN、MN患者尿标本。实验组为DN患者的尿沉渣标本,正常对照组为于同时期同医院进行体检的健康人（Healthy Control,HC）的尿沉渣标本,疾病对照组为糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）及NDRD（DM合并IgA及DM合并MN）患者。留取肾脏穿刺活检术前当日凌晨的尿液标本,经过离心机离心后获得尿沉渣并于-80℃冰箱内保存。2.使用安捷伦公司miRNA V21.0芯片对5个HC、5个DM、6个DN、9个NDRD（5个DM合并IgA及4个DM合并MN）患者尿沉渣进行microRNA表达谱的测定。对各组表达水平差异有统计学意义的microRNAs进行综合分析,同时利用GO（Gene Ontology,GO）数据库及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）等数据库和生物信息分析技术进一步筛选。3.运用RT-qPCR技术,扩大验证样本量,在24例DN患者,49例NDRD患者（DM合并IgA肾病23例,DM合并膜性肾病26例）中对芯片筛选出的差异miRNAs在实验组与对比组间的表达水平进行检验,进一步绘制受试者作业特征（Receiver Operating Characteristic,ROC）曲线用,评估所筛选出miRNAs标志物诊断DN的敏感度和特异度,并分析其与DN临床指标的相关性。结果1.我们构建了HC,DM,DN,NDRD患者尿沉渣细胞microRNA表达图谱,芯片结果显示:DN组与HC组相比,共有109个miRNAs表达水平差异有统计学意义,DN组与DM组相比,共有126个miRNAs表达水平差异有统计学意义,DN组与NDRD组相比,共有63个miRNAs表达水平差异有统计学意义均（P<0.05且差异倍数>1.500或<0.667）。2.进一步使用RT-PCR技术对芯片实验结果验证,结果显示,DN患者与NDRD患者尿沉渣中的miR-31-3p、miR-135b-5p和miR-1290表达水平存在统计学差异（P=0.003,0.003,0.002）,且符合筛选芯片miRNA表达趋势。miRNA表达水平用2-△△CT表示,三个miRNAs在DN组的表达水平均高于NDRD组（P<0.05）。将验证队列验证所得DN组及NDRD组差异表达的miRNAs绘制ROC曲线,AUC（area under the curve,AUC）表示曲线下面积,miR-31-3p、miR-135b-5p和miR-1290曲线下面积分别为0.691、0.698、0.653,灵敏度分别为0.542、0.792、0.583,特异度分别为0.792、0.551、0.864。DN中miR-135b-5p与ACR水平存在着显著的正相关性。结论1.通过芯片发现,发现HC、DM、DN、NDRD四组间有大量差异表达的miRNA,验证队列发现,miR-31-3p,miR-135b-5p和miR-1290在DN组与表达水平高于NDRD组,且组间差异均具有统计学意义。2.miR-31-3p,miR-135b-5p和miR-1290具有一定诊断效能,3个miRNAs有望成为DN的无创生物诊断标志物。DN中miR-135b-5p与ACR水平存在着显著的正相关性,或可作为病情严重程度的重要指标。