研究背景与意义结直肠癌(Coloretal carcinoma,CRC)是人类常见的恶性肿瘤之一,结直肠癌转移是影响患者治疗效果和导致患者死亡的主要原因,控制转移是结直肠癌防治的关键环节。临床上,一半以上的结直肠癌患者在行根治性手术前已出现了微转移,这是结直肠癌术后转移和复发的直接原因。结直肠癌的转移,像其他恶性肿瘤一样,是一个逐步和级联的过程。首先,肿瘤细胞必须先从原发瘤部位脱落、进入血管和／或淋巴管,然后在循环中生存、黏附于继发器官微血管、渗出血管和／或淋巴管、进入继发器官组织,最后形成微转移瘤并诱发血管发生,最终形成转移瘤。事实上,不是每一个肿瘤细胞都能够经过上述过程到达转移部位并形成转移瘤。在转移过程中,大约有90%的转移细胞可以侵入循环系统并最终到达肿瘤转移部位,仅有2%的细胞可以形成微小转移瘤,0.02%的细胞能够有效诱发血管的生成并最终形成转移瘤。目前对肿瘤转移机制的研究往往针对单个或少数几个分子对肿瘤转移的影响,缺乏系统性的综合分析,不能明确究竟哪些分子在肿瘤转移中发挥关键作用。近年来,比较蛋白质组学的应用为肿瘤转移机制的研究提供了系统性的筛查方法。综合应用蛋白组学分析与分子生物学技术,阐明结直肠癌转移相关的分子机制,寻找预防和治疗结直肠癌转移的有效途径是目前结直肠癌研究的重要课题。肿瘤干细胞(cancer stem cell, CSC)学说认为在实体瘤中存在一部分细胞,其增殖缓慢,具有与干细胞相似的自我更新能力和分化潜能,只有这群细胞才能形成肿瘤,这些细胞是肿瘤形成的种子和源泉。CSC与肿瘤的发生、治疗、预后、复发和转移关系极为密切。肿瘤转移干细胞(metastatic cancer stem cell, MCSC)隶属于CSC亚群,其生物学特性与CSC类似,除了具有自我更新,能够分化产生肿瘤谱系异质性的肿瘤细胞,包括肿瘤祖细胞(progenitor cell)、移行扩增细胞(transit-amplifying cell)和成熟肿瘤细胞(mature cancer cell)之外,还具有形成转移瘤的能力。CSC是肿瘤起始细胞,MCSC是肿瘤转移的源泉。MCSC功能蛋白的表达及其信号机制是其区别于CSC的分子基础。由于肿瘤转移过程是由一组相关基因启动,因而由一群基因组成的分子标签(Molecular Signatures)更能体现肿瘤转移的临床过程。分子标签是以一定数量的基因或蛋白作为一个整体,来判断或定义某些生物学特性。与单个的分子模式不同,分子标签不但以单基因功能研究为基础,而且更加注重基因之间的共同协调作用,从整体和系统水平上对某种特定的生物学特性进行描述。比较蛋白质组学技术是获得分子标签的重要手段之一。目前,通过比较蛋白质组学研究,已经从前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌和食管癌等恶性肿瘤中分离出新的侯选分子,其中部分分子有可能成为新型肿瘤诊断标志物和治疗靶标。因此分离与鉴定结直肠癌MCSC,确定MCSC的存在,筛选MCSC特征性的分子标签,把它们与正常干细胞和CSC区别开来,从MCSC方面解密肿瘤转移机制。筛选和鉴定结直肠癌MCSC分子标签,可用于肿瘤转移的预后判断与转移诊断,有利于建立新型抗肿瘤转移策略。本课题通过有限稀释法,从人结直肠癌细胞系SW480中获得结直肠癌干细胞样克隆,应用裸鼠皮下成瘤确定结直肠癌CSC克隆,裸鼠盲肠原位移植模型筛选和鉴定结直肠癌MCSC和非转移干细胞克隆(non-metastatic cancer stem cell,nMCSC);双向凝胶电泳结合质谱分析,筛选出与结直肠癌MCSC转移特征相关蛋白；结合临床随访资料分析,验证MCSC分子标签与结直肠癌转移的相关性；应用基因过表达技术,在体外和体内研究MCSC分子标签的功能,探讨相关基因与结直肠癌转移的相关性。筛选和鉴定结直肠癌MCSC分子标签,为结直肠癌转移的分子机制研究,结直肠癌转移的早期预警、早期诊断和抗转移治疗提供新理论和新靶标,应用MCSC的全新理念来阐述结直肠癌转移机制。方法1.结直肠癌肿瘤干细胞的分离、培养及其鉴定利用有限稀释及无血清培养法从人结肠癌细胞系SW480单克隆培养肿瘤干细胞克隆亚系。应用Western Blot、免疫荧光、流式细胞学检测母系SW480及各克隆球CD133、CD44、CK7的表达情况。应用软琼脂集落实验及裸鼠皮下细胞接种确定克隆球CSC特性。2.人结直肠癌BALB/c-nu裸鼠动物模型筛选转移潜能不同的肿瘤干细胞克隆将处于对数生长期的人结肠癌SW480及各肿瘤干细胞克隆细胞1×106个注射入一只裸鼠皮下,待瘤块直径达8mm左右时,在无菌的条件下取出瘤块,放入冰浴中的无血清RPMI-1640培养基中,用剪刀剪成1mm3的小块备用。取五只6周龄的BALB/c-nu裸鼠,用1%的戊巴比妥(1ml/kg)将其麻醉后,左下腹切口,用镊子拖出盲肠,刮除少许浆膜组织,用7/0带线缝合针将体积为1mm3的瘤块荷包式缝合于损伤的浆膜处,将盲肠送回腹腔,缝合腹壁切口。50天后,当裸鼠出现恶病质后,全部处死裸鼠,常规对各脏器取材,制作石蜡切片,HE染色,观察肿瘤的转移情况。应用裸鼠皮下成瘤实验检测母系SW480及转移潜能不同的肿瘤干细胞克隆亚系成瘤能力；应用侵袭小室实验检测母系SW480及转移潜能不同的肿瘤干细胞克隆亚系体外侵袭能力；应用Western Blot、免疫荧光检测母系SW480及转移潜能不同的肿瘤干细胞克隆亚系上皮-间质转化标记物Fibronectin、 Vimentin和E-cadherin的表达；3.转移潜能不同的结直肠癌肿瘤干细胞蛋白质组学分析及质谱鉴定为了更好的理解大肠癌转移机理和寻找大肠癌转移干细胞相关分子标签,我们运用双向凝胶电泳技术对人结直肠癌SW480和转移潜能不同的肿瘤干细胞克隆亚系细胞进行了差异表达双向凝胶电泳分析。在蛋白和mRNA水平对候选蛋白进行了进一步验证,保证蛋白质组技术鉴定结果的可靠性。4.结直肠癌干细胞转移相关蛋白的表达及功能验证应用比较蛋白质组学方法筛选出结直肠癌MCSC克隆和非转移肿瘤干细胞克隆(non metastatic cancer stem cell, nMCSC)的差异表达蛋白质,通过生物信息学分析和文献挖掘,确定与结直肠癌发生、发展及转移相关的蛋白质,对于这些蛋白的确切生物学特性和临床意义尚待进一步验证和证明。我们选择其中感兴趣的结直肠癌转移相关蛋白ERp2、CLIC4、Sma、ISG15,通过临床研究和生物学功能研究,以期初步探讨它们在结直肠癌发生、发展及转移中的作用,同时也进一步验证前期蛋白质组学筛选研究结果的可靠性,为后续针对专门靶点进行的研究奠定基础。结果1.筛选和鉴定结直肠癌CSC克隆：应用有限克隆稀释和无血清培养法,共计接种10块(约1000个孔)96孔板,培养获得SW480单细胞源性肿瘤干细胞球克隆12个(L1-12),克隆形成率约为1.2%(12/1000),肿瘤细胞球为悬浮生长,细胞为圆形,无明显突起,球内细胞折光性好,连接紧密,不能准确区分细胞与细胞间界限。通过低数量级裸鼠皮下成瘤实验和免疫表型分析,鉴定筛选的克隆为肿瘤干细胞球。500个结直肠癌CSC就能够在裸鼠皮下有效成瘤,而母系SW480细胞至少需要106个细胞才能裸鼠皮下致瘤。2.结直肠癌CSC克隆侵袭和转移潜能比较：将12个肿瘤干细胞球及其亲本细胞株SW480进行了裸鼠盲肠原位移植试验,建立结直肠癌原位移植动物模型,筛选转移能力差异明显的CSC克隆,L7克隆5只裸鼠全部出现了肝转移(5/5),4只出现了肺转移(4/5),另外可见肠系膜淋巴结转移(5/5),从而确定为MCSC克隆。而在L4克隆5只裸鼠中隆仅在盲肠壁内形成肿瘤,腹腔淋巴结、肝脏与其它器官内未见转移瘤形成,从而确定为nMCSC克隆。其它克隆在腹腔淋巴结、肝脏与其它器官内发生了不同程度的转移。侵袭小室检测结果表明,MCSC克隆侵袭能力高于nMCSC克隆,差异具有统计学意义(F=117.857,P<0.001)。MCSC克隆裸鼠皮下成瘤能力强于nMCSC克隆(F=53.229,P=0.000)。3.结直肠癌MCSC克隆和nMCSC克隆EMT特性比较：上皮-间质转变(epithelial-mesenchymal transition,EMT)被认为是肿瘤转移过程中出现的动态演变,免疫荧光及Western Blot标记肿瘤转移相关的上皮间质转变蛋白(Fibronectin、Vimentin、E-cadherin),MCSC克隆低表达E-cadherin, nMCSC克隆较高表达E-cadherin,但是MCSC中,Fibronectin和Vimentin表达均高于母系SW480和nMCSC.4.结直肠癌MCSC克隆转移相关蛋白的筛选：采用双向凝胶电泳联合质谱的蛋白质组学研究策略,筛选出结直肠癌转移相关蛋白24个；在MCSC中高表达的有13个,低表达的有11个。这些蛋白参与的多数生物学功能与细胞的增殖、运动、黏附等特性有关,而这些作用与肿瘤的转移特性密切相关。研究结果为阐明结直肠癌转移机制及寻找预测结直肠癌MCSC的潜在标志物提供了理论依据。我们选定4个可能与实体瘤转移相关的蛋白CLIC4、Smac、ERp29、ISG15进行初步的功能鉴定。为保证蛋白质组技术鉴定结果的可靠性,在蛋白和mRNA水平对候选蛋白进行了进一步验证。应用Real-Time PCR、Western Blot及免疫荧光检测MCSC、nMCSC及其亲本母系细胞株SW480中CLIC、Smac、 ERp29、ISG15蛋白在mRNA水平和蛋白质水平的表达情况,检测结果与双向电泳结果一致。5.结直肠癌MCSC克隆转移相关分子标签的功能研究：应用具有10年完整随访资料的421例临床结直肠癌标本,对CLIC4、Smac、ERp29、ISG15在蛋白质水平的表达进行验证,检测这四种蛋白在患者肿瘤组织中的表达情况,并与患者的临床特性进行相关性分析。免疫组化结果表明：高表达CLIC、Smac、 ERpP29、ISG15与患者的不良预后密切相关(P<0.05)。应用基因过表达方法,观察这四种蛋白对结直肠癌细胞生物学特性的影响。平板克隆形成实验显示过表达ERp39、ISG15的nMCSC细胞及MCSC克隆形成能力明显增强,差异具有显著的统计学意义(F=63.900,P=0.000),侵袭小室实验证明过表达CLIC4、Smac、ERp29的nMCSC细胞球体外侵袭能力增强,过表达ISG15的MCSC细胞球体外侵袭能力减弱,差异具有统计学意义(F=100.111,P=0.000),说明CLIC4、Smac、ERp29、ISG15与结直肠癌细胞的运动迁移能力有关。裸鼠体内原位移植实验表明,ERp29、Smac、ISG15可以提高肿瘤细胞的增殖和克隆形成能力,CLIC4、ERp29、Smac可以增强肿瘤细胞的侵袭和运动潜能,ISG15可以抑制肿瘤细胞的侵袭和转移潜能。结论1.应用有限克隆稀释及无血清培养法筛选出来自同一亲本结直肠癌细胞系SW480的单细胞源性CSC克隆12个,有限克隆稀释法能够有效获得结直肠癌CSC克隆。2.应用裸鼠皮下成瘤实验与盲肠实验转移模型能够确定结直肠癌CSC克隆存在转移潜能的异质性。3.采用双向凝胶电泳联合质谱的蛋白质组学研究策略,筛选出来源于同一亲本结直肠癌细胞系中具有不同转移潜能的CSC克隆表达蛋白质谱不同。4. CLIC4、ERp29、Smac及ISG15维持结直肠癌MCSC的肿瘤细胞干性和转移特性,可以作为新的结直肠癌转移与预后的分子标记物。本研究的创新之处1.确定结直肠癌转移干细胞的分子标签。2.确定结直肠癌转移干细胞分子标签与临床结肠癌转移的相关性,为肿瘤转移的早期诊断及治疗提供新靶标。3.结直肠癌转移干细胞分子标签与肿瘤不良预后有关,可作为肿瘤转移预后判断、转移诊断和转移治疗的分子依据。4.确定肿瘤转移干细胞是结直肠癌转移的直接结果,为抗肿瘤转移的实验性治疗研究与临床治疗应用提供新的理论依据。