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实验目的1.研究蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)后迟发性脑血管痉挛大鼠模型的基底动脉管径、行为学测试的动态变化,探讨SAH后大鼠的认知功能障碍程度。2.研究SAH后迟发性脑血管痉挛大鼠PSD-95(postsynaptic density protein-95)、N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)表达的动态变化,探讨PSD-95和NMDAR在SAH后迟发性脑血管痉挛损伤及认知损害中的作用和可能机制。研究方法1.将健康成年Wistar大鼠42只,应用枕大池自体动脉血溶血物注入法建立SAH模型,将动物随机分为正常组、假手术组、SAH后12h、1d、3d、5d、14d组。应用体视显微镜对基底动脉进行形态学观察,应用活体循环检测系统动态检测活体基底动脉管径;应用Morris水迷宫实验进行行为学检测,计算平均潜伏期及其在平台象限游泳时间占总游泳时间百分比,检测各组不同时间点的学习成绩。2.将健康成年Wistar大鼠42只,应用枕大池自体动脉血溶血物注入法建立SAH模型,将动物随机分为正常组、假手术组、SAH后12h、1d、3d、5d、14d组。应用免疫组织化学方法对脑组织切片进行染色后,于光镜下观察脑组织中PSD-95及NMDAR分布,及在海马和皮层中的表达的动态变化。3.将健康成年Wistar大鼠42只,采用枕大池自体动脉血溶血物注入法建立SAH模型,将动物随机分为正常组、假手术组、SAH后12h、1d、3d、5d、14d组。制备各组动物的脑匀浆后,蔗糖密度梯度离心法分别提取各组动物皮层和海马的突触小体,充分裂解离心后进行Western blot检测,Gelpro32分析软件分析各组样本PSD-95及NMDAR表达量的差异。结果1.与正常大鼠相比,SAH后的大鼠出现毛发蓬乱,摄食、运动量减少。精神淡漠,嗜睡,躁动不安,站立不稳,呈头低位蜷缩状,于鼻腔处可见到暗红色血迹和眼角充血物。对SAH大鼠处死后观察其颅脑组织,可见到有明显的蛛网膜下腔出血表现,溶血物主要弥漫覆盖于颅底的主要血管、蝶鞍、后颅窝、前颅窝等部位。各组动物均没有发生自发性的脑组织出血或实验过程的机械损伤,溶血物基本来源于自体动脉血。2.通过对正常组、假手术组和SAH术后3d的大鼠活体基底动脉管径观察,结果表明,相比于正常组,假手术组BA管径基本变化不大,而模型组可见BA发生明显收缩痉挛,管径明显变小,平均约为假手术组的42.2%。3.研究SAH大鼠的定位功能,第1d发现各实验组大鼠的逃避潜伏期没有明显差异,SAH5d及14d组大鼠在训练第2天、SAH3d组大鼠在训练第4天均出现显著的平均潜伏期延长,而正常组和假手术组大鼠的潜伏期稳定逐渐发生明显的下降趋势(P<0.05)。空间探索实验研究中,统计正常组大鼠与假手术组大鼠的平台象限游泳时间百分比未见显著差异,而SAH5d及14d组大鼠穿越特定平台象限游泳时间占游泳总时间的比例相比于假手术组的大鼠发现明显降低(P<0.01)。4.在显微镜下观察,PSD-95、NMDAR免疫沉淀物主要分布于海马组织的锥体细胞(主要CA1、CA3)及齿状回,其次是大脑皮质。细胞膜表面染色呈现棕色颗粒,胞浆淡染,树突中也有表达。半定量分析表明,SAH组中早期短暂升高后PSD95、NMDAR表达逐渐减少,以CA1区尤为明显,与假手术组相比,SAH5d、14d组降低明显(P<0.05)。Western blot法分析各实验组皮层和海马中PSD95和NMDAR的表达进行半定量分析后表明,PSD95和NMDAR的表达随时间延长逐渐降低,与假手术组相比,出血后5d和14d组表达显著降低(P<0.05)。结论1.Wistar大鼠通过枕大池自体动脉血溶血物注入法可成功制作SAH模型,造模后3d脑血管痉挛明显。2.SAH迟发性脑血管痉挛大鼠造模7天后即可出现不同程度的认知功能障碍。3.SAH后大鼠大脑皮层和海马PSD-95及NMDAR表达总体呈降低趋势,以SAH后5d、14d降低最为显著,说明PSD-95、NMDAR水平与SAH后DCVS的发生发展存在一定的相关性。PSD-95与NMDAR二者之间存在协同作用,PSD-95很可能成为治疗SAH后认知功能障碍的新的靶点之一。