【摘 要】
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γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）是个在自然界广泛存在的一种非蛋白质氨基酸,在神经递质信号中起到抑制性神经传递的作用,可以应用于食品,医药以及饲料等行业。谷氨酸脱羧酶GadB是一种磷酸吡哆醛（PLP）的依赖性酶,该酶能够催化L-Glu或者L-MSG生成GABA,目前己经有了许多制备GABA的相关文献,但是将辅酶因子PLP合酶基因构建到质粒上进而对菌株发酵培养,国内外几
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γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）是个在自然界广泛存在的一种非蛋白质氨基酸,在神经递质信号中起到抑制性神经传递的作用,可以应用于食品,医药以及饲料等行业。谷氨酸脱羧酶GadB是一种磷酸吡哆醛（PLP）的依赖性酶,该酶能够催化L-Glu或者L-MSG生成GABA,目前己经有了许多制备GABA的相关文献,但是将辅酶因子PLP合酶基因构建到质粒上进而对菌株发酵培养,国内外几乎没有报道。本课题的研究如下:（1）质粒的构建:基因敲除菌E.coliK12ΔgabTΔgabPΔpuuE经过初步发酵培养,10g/L的L-MSG培养基发酵产生了0.21g/L的GABA,相较于原始菌株E.coil K12的产量0.05g/L,产量提高了430%,说明出发菌株E.coliK12 ΔgabTΔgabPΔpuuE具有提高GABA的能力。第二步开始构建质粒,扩增出基因gadB,SNO1,SNZ1,通过基因工程的方法,分别构建到质粒pTrc99a上,涂抗性平板挑选菌落,经过验证两个质粒pTrc99a-gadB、pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1均构建成功。（2）两个重组菌株构建以及发酵条件优化:将两个质粒导入到感受态细胞,得到菌株E.coliK1 2 ΔgabTΔgabPApuuE/pTrc99a-gadB,E.coliK12 Δgab TΔgabPΔpuuE/pTrc99a-gadB-SNO1-SNZ1。当连有gad B质粒的菌株在10g/L的L-MSG中发酵时,GABA的最大含量为4.6g/L,生物转化率为76.6%;第二个菌株同条件下发酵,得到的GABA最大产量为4.2g/L。分别用五个浓度梯度底物的L-MSG（5g/L,10g/L,20g/L,30g/L,40g/L）分别摇瓶发酵两个菌株,分别测量GABA产量和相对应的生物转化率,得到菌株E.coliK12 ΔgabTΔgabPΔpuuE/pTr c99a-gadB在L-MSG（5g/L,10g/L,20g/L）的条件下,能有75%以上的生物转化率;菌株E.coliK12 ΔgabTΔgabPΔpuuE/pTrc99a-gadB-SN O1-SNZ1相对应的有61.6%的生物转化率。摇瓶1L扩大培养菌株E.col iK12 ΔgabTΔgabPΔpuuE/pTrc99a-gadB,得到最高的GABA产量为9.4g/L,相应的生物转化率为76.7%。（3）酶的纯化以及酶学性质研究:通过硫酸铵盐析法初步分离,DEAE-52纤维素离子交换层析再次分离的方法,得到纯的GadB蛋白,SDS-PAGE电泳分析,结果分子量约为53Kda。酶学性质测定,得到了酶的最适反应温度为37℃;最适反应pH为4;最适温度下3h保温催化以及最适pH条件下,酶的稳定性都表现良好;金属离子对GadB酶活力均具有不同程度的影响,其中Ba2+,Na+,K+两个金属离子对Ga dB酶活力基本没有影响,谷氨酸脱羧酶GadB活性在96%上下波动。金属离子Ni2+的抑制作用较强,酶活力下降到了 80%。
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