【摘 要】
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肌苷是一种多功能嘌呤核苷,参与机体内的物质代谢和能量供应,广泛应用在医药和食品领域。微生物发酵法因成本低廉,能耗较低,环境友好,是肌苷大规模工业化生产的理想方法。随着市场需求量的不断攀升,对肌苷生产菌株提出了更高的要求。为此,本研究以大肠杆菌标准株MG1655为出发菌株,采用CRISPR/Cas9基因编辑方法对肌苷代谢网络进行了系统代谢工程改造,获得了一株稳定高效的肌苷工程菌株。其主要研究内容如下
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肌苷是一种多功能嘌呤核苷,参与机体内的物质代谢和能量供应,广泛应用在医药和食品领域。微生物发酵法因成本低廉,能耗较低,环境友好,是肌苷大规模工业化生产的理想方法。随着市场需求量的不断攀升,对肌苷生产菌株提出了更高的要求。为此,本研究以大肠杆菌标准株MG1655为出发菌株,采用CRISPR/Cas9基因编辑方法对肌苷代谢网络进行了系统代谢工程改造,获得了一株稳定高效的肌苷工程菌株。其主要研究内容如下:首先,依次敲除rih A、rih B、rih C、deo D、ppn P、gsk基因,以阻断肌苷分解途径,构建重组菌株INO1-6。摇瓶发酵结果显示,菌株生长未受明显影响,为肌苷合成效率的提升奠定了基础。进一步地,引入解淀粉芽孢杆菌的嘌呤操纵子,以强化嘌呤从头合成途径,又过表达解淀粉芽孢杆菌来源的pur FbazK316Q突变基因,以解除PRPP转酰胺酶反馈抑制,依次构建重组菌株INO2-6和INO2-9。摇瓶发酵结果显示,两株菌株的肌苷产量分别为155.2 mg/L和308.3 mg/L。进一步地,将pur A基因替换为枯草芽孢杆菌来源的pur AbsuP242N突变基因,以弱化腺苷合成支路,构建重组菌株INO3-4。摇瓶发酵结果显示,在0.3 g/L腺嘌呤添加量下,肌苷产量为1412.5 mg/L,较直接阻断腺苷支路菌株提高了19.6%。进一步地,敲除pur R基因,以解除prs基因反馈阻遏,又过表达大肠杆菌来源的prsecoD128A突变基因,以解除PRPP合酶反馈抑制,依次构建重组菌株INO4-1和INO4-2。摇瓶发酵结果显示,两株菌株的肌苷产量分别为1.6 g/L和3.1 g/L,较各自出发菌株分别提高了14.3%和93.8%。进一步地,过表达解淀粉芽孢杆菌来源的pbu E基因,以增强肌苷的外排,又敲除nup C基因,以减弱肌苷的摄取,依次构建重组菌株INO5-2和INO5-3。摇瓶发酵结果显示,两株菌株的肌苷产量分别为3.9 g/L和4.5 g/L,较各自出发菌株分别提高了25.8%和15.4%。最后,利用5 L发酵罐对重组菌株INO5-3进行分批补料发酵。发酵结果显示,经48 h发酵,肌苷产量为20.2 g/L,糖酸转化率为0.12 g肌苷/g葡萄糖,生产强度为0.42g肌苷/L/h。该菌株非缺陷型,稳定高效,不含质粒,发酵周期短,为后续工业化应用奠定了扎实基础。
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