论文部分内容阅读
弓首蛔虫病（Toxocariasis）主要是由犬弓首蛔虫（Toxocara canis,T.canis）寄生于宿主小肠而引起的一类寄生虫病。该病具有世界性分布的特点,有数据显示,世界各地T.canis的感染率为0.9%64.7%。其感染性虫卵不仅可以感染犬,还可以感染多种动物及人类,能引起眼睛幼虫移行症（Ocular larva migrans,OLM）、神经幼虫移行症（Nerve larvae migration,NLM）、隐秘幼虫移行症（Cryptic larval migration,CLM）和内脏幼虫移行症（Visceral larva migrans,VLM）,导致严重的病理综合征。因此,该病在兽医公共卫生学上具有十分重要的意义。卵黄原蛋白（Vitellogenin,Vg）是脂质转运蛋白家族成员之一,通常是在卵生非哺乳动物的卵巢外组织中合成,经卵黄原蛋白受体（Vitellogenin receptor,Vg R）介导的胞吞作用进入卵巢,分解为卵黄蛋白（Yolk protein,YP）、卵黄脂磷蛋白（Lipovitellin,Lv）、卵黄高磷蛋白（Phosvitin,Pv）等功能性物质。研究发现,Vg不仅为胚胎发育提供营养元素,还具有促进动物卵母细胞的生长和分化、粒子载体、生物标志物、抗氧化活性、免疫防御等多种生理功能。随着秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）卵黄原蛋白基因的发现,陆续展开了对有齿食道口线虫（Oesophagostomum dentatum）、捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）、毛圆线虫（Trichostrongylus vitrinus）等寄生虫卵黄原蛋白的相关研究,而有关犬弓首蛔虫Vg的研究还未见报道。本论文在实验室已有的T.canis转录组数据基础上,对犬弓首蛔虫卵黄原蛋白（T.canis-vg,Tc-vg）基因进行了克隆、原核表达和组织定位等相关研究。主要试验结果如下:1.Tc-vg基因的生物信息学分析运用分子生物学技术对Tc-vg基因进行了分析,结果显示该基因为一个完整的编码区序列（Coding sequence,CDS）,大小为5082 bp,可编码1694个氨基酸;理论分子质量为198 kDa,等电点为6.19。信号肽在线预测显示其N端含有一个信号肽,裂解位点在18-19 aa处。由在线软件分析显示该蛋白在一级结构上以亲水性为主;含有三个功能结构域:VitellogeninN、DUF1943（domain of unknown function）以及v WD（von Willebrand factor type D domain）。二级结构中含有α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲。在线分析Tc Vg磷酸化位点显示该蛋白中存在三种主要的磷酸化氨基酸,即磷酸化苏氨酸（p Thr）、磷酸化酪氨酸（p Tyr）和磷酸化丝氨酸（p Ser）共44个,分别为7、19、18。亚细胞定位分析为分泌通路;功能预测显示参与脂质分子的转运过程。根据Blast比对发现Tc-vg与猪蛔虫（Ascaris suum）、美洲钩虫（Necator americanus）和小杆线虫（Caenorhabditis briggsae）的相似性高达100%;系统进化分析显示Tc-vg与A.suum（ERG83573）的亲缘关系最近;与N.americanus（XP013298422）、线虫（Pristionchus pacificus,KKA71696）、十二指肠钩虫（Ancylostoma duodenale,KIH69020）、捻转血矛线虫（Haemonchus contortus,CDJ93502）、胎生网尾线虫（Dictyocaulus viviparus,KJH46366）等的亲缘关系次之。2.Tc-vwd与Tc-duf1943结构域的克隆运用PCR技术,克隆获得了Tc-vg基因的两个功能结构域（Tc-duf1943和Tc-vwd）。其中,Tc-vwd结构域长度为834 bp,ORF长度为816 bp,编码272 aa,预测蛋白分子量大小为31.15 kDa,等电点为5.12。犬弓首蛔虫v WD（T.canis-v WD,TcvWD）蛋白主要参与发病机理的生物学过程。Tc-duf1943结构域长度为882 bp,ORF大小为864 bp,编码288 aa,预测成熟蛋白分子量为33.25 kDa,等电点为9.57。犬弓首蛔虫DUF1943（T.canis-DUF1943,Tc DUF1943）蛋白主要具有脂质定位和有机物质运输的生物学过程。3.Tc-vwd/pET28a与Tc-duf1943/pET28a表达载体的构建及原核表达按照TaKaRa公司的质粒提取试剂盒的说明对Tc-vwd/pMD19-T、Tc-duf1943/pMD19-T和pET28a等质粒进行提取,酶切之后目的基因与pET28a进行连接,转化E.coli DH5α细胞,平板培养过夜,挑取单个白色菌落培养,PCR、双酶切及测序鉴定,将测序正确的重组质粒Tc-vwd/pET28a与Tc-duf1943/pET28a转化E.coli BL21（DE3）表达菌,挑取单菌落培养,当OD600值达到0.61.0时,加入IPTG进行诱导表达,同时对菌液进行IPTG浓度梯度和时间梯度的优化,筛选最佳的诱导条件。结果显示重组蛋白TcvWD与Tc DUF1943均以包涵体形式存在,其中TcvWD大小约为40 kDa,Tc DUF1943大小约为35 kDa;TcvWD蛋白于37°C,0.4 m M的IPTG诱导6 h时表达量最高,Tc DUF1943在37°C,0.4 m M的IPTG诱导4 h时表达量最高。4.TcvWD多克隆抗体的制备及Western blot检测对Tc-vwd/pET28a/BL21进行大量表达,离心收集包涵体沉淀,8 M尿素溶解,纯化上清,将重组蛋白TcvWD免疫新西兰白兔,2-3周免疫一次,共免疫四次,当效价大于1:50000时进行最终采血制备抗血清,对所得抗体进行效价、浓度、纯度测定。结果显示TcvWD融合蛋白纯度较高,所得抗体效价为1:512000,浓度为0.82 mg/ml,纯度合格。Western blot显示TcvWD能够与免疫抗血清反应,而不与免疫前血清反应,即TcvWD具有良好的特异性,可用于免疫组化试验。5.Tc-vg特异性表达和Tc Vg免疫组织化学分析运用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,q RT-PCR）方法检测Tc-vg基因的组织差异表达情况。结果显示Tc-vg基因在犬弓首蛔虫雌、雄虫肠道、生殖道和体壁均有表达,其中肠道表达量最高,体壁、生殖道次之。利用免疫组织化学技术对Tc Vg的组织分布情况进行了检测,结果显示Tc Vg在雌虫、雄虫各组织中均有表达,其中在肠道中高量表达,在生殖道和体壁如肌肉细胞、子宫和输精管内有较弱表达。