论文部分内容阅读
柔嫩艾美尔球虫(Eimeria. tenella)是鸡球虫中致病力最强的球虫。迄今,对柔嫩艾美尔球虫(E.tenella)的病原形态、生活史及流行特点方面已有较深入的研究。但由于对艾美尔球虫免疫机制、特别是固有免疫机制的研究较少,制约了球虫疫苗研发的进展。模式识别理论(pattern recognition receptor, PRRS)的提出,使人们扩宽了对球虫固有免疫机制的认识,Toll样受体(toll-like receptors, TLRs)是固有免疫反应中重要的模式识别受体。目前,对哺乳动物TLRs的种类、配体、生物学功能有了较为全面的了解,给予研究者们对抗球虫疫苗的研制提供了新的思路。近年来,禽类TLRs的研究也有了一定进展,但主要集中在TLRs与细菌、病毒感染方面的研究,而在寄生虫感染对禽TLRs表达的影响方面的相关研究相对较少。本试验以固有免疫学理论为指导,以分子生物学、细胞生物学和生物信息学为研究手段,探索鸡在抗E. tenella感染中TLRs的固有免疫应答作用。主要开展以下几个方面的研究：(1)检测6-21不同日龄阶段雏鸡盲肠中TLRs mRNA的表达量；(2)通过两种剂量E. tenella体内感染15日龄雏鸡,检测其盲肠组织中TLRs mRNA的表达量变化；(3)用E. tenella第二代裂殖子体外刺激鸡外周血单核-巨噬细胞,检测单核-巨噬细胞中TLRs mRNA的表达量,并收集上清液检测IL-6、IL-12、IL-10及IFN-γ的内含量。1.6-21不同日龄阶段雏鸡盲肠组织中TLRs mRNA的表达分别在6、9、12、15、18和21日龄时采集雏鸡盲肠组织,用SYBR Green I荧光定量PCR法检测鸡盲肠组织中TLRs mRNA表达量,研究不同日龄阶段雏鸡盲肠中TLRs mRNA的表达变化情况。试验结果显示：鸡TLRs (ChTLR)在6-21小同日龄雏鸡盲肠中均有表达。其中,6日龄时ChTLRs mRNA的表达均呈较高水平；9日龄时除ChTLR3外,其它各种ChTLRs mRNA的表达较6、12日龄显著下调(P＜0.05)；12日龄时除ChTLR3外,其它各种ChTLRs mRNA的表达均高于其它日龄,日ChTLR2、ChTLR4、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15mRNA的表达显著升高(P<0.05)；ChTLR3mRNA的表达在6、9、12日龄变化不明显(P＞0.05)；但在15、18、21日龄时,雏鸡盲肠中TLRs mRNA的表达均极显著低于6、12日龄(P＜0.01),且ChTLR1、ChTLR3、ChTLR4、ChTLR7、ChTLR15mRNA的表达较9日龄也显著下调。结果表明：除TLR3,6-21不同日龄阶段雏鸡盲肠组织中TLRs mRNA的表达变化情况相似,TLR3mRNA的表达变化在6、9、12日龄时不明显。2.两种剂量E.tenella感染对雏鸡盲肠中TLRs mRNA表达的影响为研究E. tenella感染剂量对鸡盲肠组织的免疫应答,本试验分别选用两种不同感染剂量5,000和150,000个E. tenella卵囊/只口服接种15日龄雏鸡,并设立不感染对照组。荧光定量PCR法检测感染后1-7天内雏鸡盲肠中TLRs mRNA的表达水平。结果发现：接种5,000卵囊／只鸡中TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15及TLR21mRNA表达在第4-5天都呈显著升高(P<0.05)，且TLR4、TLR5mRNA表达在第1天极显著上调(P<0.01),分别为对照组的4.7、5.3倍；而TLR5、TLR21mRNA的表达在第7天呈抑制性表达,分别为对照组的0.32、0.31倍。接种150,000卵囊／只鸡TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15及TLR21mRNA表达在第2、4及5天均显著下调(P<0.05),但TLR7、TLR15mRNA表达在第6天又显著升高,第7天TLR5、TLR21mRNA表达分别为对照组的0.24、0.34倍,也呈显著下调。接种5,000卵囊／只鸡在第4-5天能引起TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15、TLR21m RNA的表达显著升高,而接种150,000卵囊／只的ChTLRs在第2、4及5天mRNA的表达显著下调,表明球虫感染量大、对组织细胞的破坏性强,而引起鸡的固有免疫受到抑制。同时可以看出,参与机体的抗球虫免疫应答有多种ChTLRs:ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21。3. E.tenella第二代裂殖子刺激鸡单核-巨噬细胞中TLRs mRNA的表达变化本试验采用E.tenella第二代裂殖子(灭活和不灭活)刺激鸡单核-巨噬细胞,检测细胞的TLRs mRNA的表达变化,同时设立PBS液空白对照组。处理3h后,检测不同刺激对鸡外周血单核-巨噬细胞中TLRs mRNA表达的影响,并收集细胞上清液,并用ELISA方法检测IL-6、IL-12、IL-10及IFN-y的含量。试验结果显示,与空白对照组相比,鸡单核-巨噬细胞受到活的E. tenella第二代裂殖子刺激3h后ChTLR1、ChTLR2、ChTLR4、ChTLR5及ChTLR21mRNA的表达均呈极显著上调(P<0.01),表达量分别为空白组的17.22、64.2、5.9、88.4及226.7倍。同时也发现,E. tenella活的裂殖子与灭活组裂殖子相比,刺激鸡单核-巨噬细胞的Ch-TLR1、 ChTLR5和ChTLR21的mRNA表达量分别提高了2.9、3.0和9.1倍,呈显著上调(P<0.05)。而E. tenella活裂殖子及灭活裂殖子刺激鸡单核-巨噬细胞3h后,ChTLR3、ChTLR7、ChTLR15mRNA的表达相对于空白组均略有下调,但并不显著。ELISA检测结果发现：用E. tenella活的及灭活的第二代裂殖子分别刺激3h后,鸡单核-巨噬细胞上清液中IL-6在的含量分别为42.15、28.7pg/ml,比空白对照组(6.87pg/m1)的含量均呈显著升高(P<0.05)。IFN-γ在活裂殖子刺激的单核-巨噬细胞上清液的含量表达相对于空白组显著升高(P<0.05),其含量为208.2pg/ml,而在灭活裂殖子刺激下则差异不显著,活裂殖子刺激组细胞上清液中IL-10的含量相对于空白组、灭活组显著下调(P<0.05)。结果表明:ChTLR1、ChTLR2、ChTLR1、ChTLR5、ChTLR21能够介导活裂殖子对鸡单核-巨噬细胞的免疫应答,推测ChTLR1、ChTLR5、ChTLR21可能介导裂殖子抗原蛋白的免疫应答,并引起细胞上清中IFN-γ细胞因子含量的升高；细胞上清液中IL-6的升高表达与ChTLR1、ChTLR2、ChTLR4的上调有关。