研究背景神经胶质瘤是21世纪危害人健康的恶性肿瘤之一,其发病率居颅内肿瘤首位,具有遗传不稳定性,组织病理学表现多变以及不可预测的临床行为等特点。根据世界卫生组织基于病理结果及形态学分类描述将其分为四级,级别越高表明其恶性程度越高,高级别胶质瘤如胶质母细胞瘤等因其易向周围脑组织浸润生长,故单纯手术切除一般难以完全治愈,常术后辅以化疗、放疗,基因治疗,免疫治疗等,但预后常较差,中位生存期较短。近年来,有关胶质瘤的早期诊断,以及发生、发展机制,分子生物学治疗的靶点研究成为研究的主要目标。大量研究证实,一种新型的非编码小RNA分子—微小RNA (miRNA)在多种肿瘤中异常表达且与肿瘤的发生发展及血管形成和侵袭生长密切相关,其中包括胶质瘤。miRNA是一种内源性非编码小分子RNA(约17-20个核苷酸),它在进化过程中高度保守。通过和目标mRNA的3’-UTR靶向结合调控转录后蛋白表达和mRNA降解。初级miRNA (pri-miRNA)在RNA聚合酶Ⅱ作用下转录而来,后经核酸酶Drosha切割成长约70个核苷酸的前体。在此之后前体miRNA通过exportin-5运输到细胞质中,由Dicer复合物转化为成熟miRNA。然后很快被引导进入RNA沉默复合体(RISC)复合体中,然后可和mRNA互补配对,调控mRNA的翻译和稳定性。其对于目标mRNA的表达的调控,无论是被降解还是蛋白翻译抑制,这都完全取决于“种子”序列的互补性。在机体许多生理和病理过程中发挥重要作用,包括胚胎发育、组织生长、肿瘤发生、心律失常、缺血性心脏病、心肌肥厚、病毒性肝炎和糖尿病等。目前许多报道研究表明多种肿瘤的发生,血管生成,侵袭以及细胞凋亡等过程均和miRNA关系密切。据预测人类基因组中约有700多种miRNA,但是大多数的生物学功能仍未知。近年来关于miR-146a的研究日益引起研究者的兴趣。miR-146a位于5号染色体LOC285628基因,其成熟序列在第2外显子,其主要在先天免疫应答过程中起负调控作用,研究发现当微生物组分脂多糖(LPS)和细胞因子IL-1b、TNF-α刺激THP-1细胞时,成熟miR-146a的表达量即增加。另有报道示人类T细胞白血病病毒Ⅰ型(HTLV-I,和T淋巴细胞性白血病发生有关)、EB病毒感染和miR-146a的表达也具有相关性。其在许多炎症性疾病和肿瘤的发病机制中的作用成为目前研究的热点,这可能和其可抑制靶点的表达有关,近期研究发现在自身免疫性疾病如类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)和银屑病中miR-146a的表达量也发生变化。最初关于miR-146a在肿瘤发生中的作用是由He等研究发现在甲状腺乳头状癌患者的正常甲状腺部分,其表达量明显增高。随后,关于儿童急性淋巴细胞白血病和急性髓系白血病,淋巴瘤,鼻咽癌等肿瘤的发生发展和miRNA的表达异常的关系的报道日益增多。另外,关于其在主要骨骼肌性疾病中的异常表达也相继报道。总之,miR-146a在这些疾病发生发展中的作用和其靶基因IRAK1、IRAK2、TRAF6、RIG-I、IRF-5、STAT-1、PTC1等在翻译后抑制有关。研究已经证实,胶质瘤患者中miR-146a表达量低于正常神经胶质组织,并且在胶质瘤细胞中的表达量也低于正常神经胶质细胞,而且miR-146a的低表达患者往往WHO分级较高。研究表明miR-146a和胶质瘤的发生发展密切相关,但其具体作用机制尚不清楚。巨噬细胞移动抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor, MIF),是一种多效的炎症介质,目前被发现的最早的细胞因子之一。巨噬细胞移动抑制因子(MIF)最初是从T淋巴细胞的上清液中分离提取出来,故被描述为可溶性的具有抑制巨噬细胞迁移性能的生物因子。其分子量约为12.5kDa,由115个氨基酸构成的两个反平行α-螺旋和六个β-折叠,在内皮细胞、嗜酸性粒细胞、上皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等多种细胞中表达。其活性形式为三个相同亚基构成的同源三聚体,其羧基末端决定酶活性。MIF作为中间介质在多种疾病和肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用,包括动脉粥样硬化、急性呼吸窘迫综合征(ARDS).类风湿性关节炎等。作为一种促炎症分子,MIF在TNF-α、IL-1、 PGE2和单核细胞和巨噬细胞等活化等过程中起重要作用。miR-146a和MIF两者在胶质瘤中异常表达,我们推测MIF可能是miR-146a一个下游靶蛋白。因此,在上述基础上,本文旨在探讨miR-146a靶向调节MIF表达对胶质瘤细胞增殖的影响。本文将分三部分进行论述,分别用RT-PCR和免疫组织化学方法从基因水平和蛋白水平法检测miR-146a和IHC和MIF在不同级别胶质瘤组织和不同细胞系中的表达情况,荧光素酶报告基因分析验证MIF是否为miR-146a的下游靶向蛋白,并通过脂质体转染技术将miR-146a模拟序列转入胶质瘤细胞中,检测MIF的表达量的变化,MTT法和平板克隆形成实验检测胶质瘤细胞系细胞增殖及细胞活性测定。第一部分miR-146a和MIF在胶质瘤组织中的表达及临床意义目的探讨miR-146a和MIF在胶质瘤组织中的表达及不同病理级别的相关性分析和临床意义方法本研究收集2014年6月至2015年7月在山东大学附属省立医院经手术治疗和术后病理证实的胶质瘤组织和相应非肿瘤正常脑组织标本各20例。根据2007年WHO颅内肿瘤分期标准进行临床分期。分期如下：Ⅰ-Ⅱ期14例,Ⅲ-Ⅳ期6例。其中男性患者9例,女性患者11例,年龄31-56岁,每份标本分成两份,一份行RT-PCR检测,另一份行免疫组织化学检测MIF表达。结果1、RT-PCR结果显示miR-146a在癌旁正常脑组织和胶质瘤组织中均表达,且在脑胶质瘤组织中的表达水平显著低于癌旁正常组织,比值为(0.68±0.05)vs(0.23±0.00),差异显著(p<0.05),且随着肿瘤WHO级别的增高,其表达量降低；2、RT-PCR结果显示MIF mRNA在癌旁正常脑组织和胶质瘤组织中均表达,且在脑胶质瘤组织中的表达水平显著高于癌旁正常脑组织；3、免疫组化结果显示,MIF在胶质瘤组织中的表达显著高于癌旁正常组织(0.89±0.02)vs.(5.49±0.48),(p<0.01),且随着肿瘤恶性程度增加,其表达量亦增加;4、RT-PCR结果示当miR-146a的表达量增加时,MIF mRNA的表达量随之降低,反之,当miR-146a的表达量较低时,MIF mRNA的表达量增高。结论1、miR-146a和MIF在癌旁正常脑组织和胶质瘤组织中均表达,但在胶质瘤组织中miR-146a表达下调,MIF表达上调；2、MIF主要分布于细胞质中,且在癌旁正常脑组织和胶质瘤组织中均表达；3、miR-146a和MIF在胶质瘤中表达和胶质瘤恶性程度相关。第二部分miR-146a过表达对神经胶质瘤细胞侵袭增殖的影响目的探讨过表达miR-146a对神经胶质瘤细胞生长的影响方法体外培养U251,U87,C6三种胶质瘤细胞系以及正常星形胶质细胞(RA),分别对其进行Q-PCR检测miR-146a的表达情况。根据三种细胞系miR-146a的表达,选择U87细胞系继续进行研究,将其分成两组,分别为转染miR-146a模拟物组(miR-146a mimic组),miR-146a阴性对照组(negative control, NC组)。MTT法和平板克隆形成实验检测miR-146a对胶质瘤细胞系U87增殖活力作用的影响。结果1、实时定量PCR检测结果表明,在胶质母细胞瘤细胞系U251,U87和C6中miR-146a的表达均明显低于正常星形胶质细胞(RA),(0.20 ± 0.02,0.24 ± 0.04, 0.51 ± 0.05,0.52 ± 0.02) vs(0.75 ± 0.02),差异具有统计学意义(p<0.05)；2、MTT实验结果示,U87细胞转染miR-146a模拟物后,miR-146a mimic组细胞活力与NC组相比明显降低(P=0.0074)；3、平板克隆形成实验结果示miR-146a mimic组细胞相比NC组集落形成能力明显下降(68.34士8.23)vs(35.49士3.65),(P=0.00032)。结论1、miR-146a在正常星形胶质细胞和三种胶质瘤细胞系中均表达,但在三种胶质瘤细胞系中表达下调,且在U87细胞系中表达适中；2、miR-146a上调可降低胶质瘤细胞增殖活性；第三部分miR-146a靶向调控MIF对神经胶质瘤细胞的作用机制目的探讨miR-146a靶向调控MIF对神经胶质瘤细胞的作用机制方法miR-146a模拟物(miR-146a mimic), MiR-146a阴性对照(NC),野生型载体pGL3-MIF 3’UTR-Wt和突变型载体pGL3-MIF 3’UTR-Mut均转染至U87细胞中,分组如下：miR-146a mimics + Wt MIF, miR-146a mimics NC + Wt MIF, miR-146a mimics + Mut MIF, miR-146a mimics NC + Mut MIF。采用双荧光素酶检测系统检测转染的荧光素酶活性以及miR-146a和MIF 3’UTR基因的靶向关系。RT-PCR和Western blot分别检测U87细胞转染miR-146a mimic和NC后,MIF mRNA和蛋白表达水平的变化。结果1、miR-146a mimics + pGL3-MIF 3’UTR-Wt共转染组的荧光信号强度明显弱于其他转染组,差异有显著性(p<0.01)。然而,对于突变型载体pGL3-MIF 3’UTR-Mut,不同组的荧光强度没有明显区别(p>0.05)；2、RT-PCR和Westerm blot结果示miR-146a模拟物转染U87细胞后,MIF蛋白和mRNA的表达量下调(P=0.0045,P=0.0041)。结论miR-146a可与MIF基因3’UTR靶向结合,控制MIF基因的转录后翻译,提供了MIF转录后翻译的机制理论,可能为胶质瘤的治疗提供新的靶点。