第一部分miR-146a-5p在食管鳞癌组织和患者血清中的表达情况及其临床价值背景食管癌是全球致死率最高的消化道恶性肿瘤之一,我国95%以上食管癌患者的病理类型为食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell cancer,ESCC)。尽管食管癌的诊疗手段取得了很大的进步,但多数患者确诊时已为进展期,食管癌患者的预后依然较差,五年生存率仅为15%-25%,因此早期诊断对改善患者预后有重要价值。预后评测指标可以帮助明确食管癌患者预后的优劣,筛选出预后较差的患者,指导临床治疗。然而,现有的食管癌诊断和预后指标的敏感性和特异性较差,因此寻找高度敏感和特异的指标迫在眉睫。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是小片段非编码RNA,可以通过清除mRNA或阻碍mRNA翻译过程进而发挥对靶基因的抑制作用。越来越多的证据表明miRNAs可以发挥促癌或抑癌作用,参与肿瘤的发生、发展和转移等进程。miR-146a-5p已经在多种肿瘤中被研究报道,miR-146a-5p在乳腺癌、肺癌、胰腺癌和胃癌组织中为低表达,上调miR-146a-5p表达水平可以抑制肿瘤细胞的增殖,这与黑色素瘤、宫颈鳞癌和甲状腺癌中miR-146a-5p高表达水平正好相反,这一现象提示miR-146a-5p在不同肿瘤生长中的调控机制具有多样性。然而,miR-146a-5p在食管鳞癌中的表达水平及临床价值尚未报道,本研究旨在检测miR-146a-5p在ESCC组织和患者血清中的表达水平,探讨miR-146a-5p在ESCC预后和诊断中的价值。方法我们采用实时荧光定量 PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction,qPCR)技术检测了 62对ESCC肿瘤组织和癌旁组织、115例福尔马林固定石蜡包埋组织以及154例ESCC患者和154例正常人血清中miR-146a-5p的表达水平,并采用Kaplan-Meier曲线、Cox回归模型以及受试者工作特征(receiver-operating characteristic,ROC)曲线分析其预后和诊断价值。结果与癌旁正常组织相比,ESCC组织中miR-146a-5p的表达水平明显下降(0.50±0.36 vs 1.06±0.09,P<0.001),并且miR-146a-5p的表达水平与食管癌患者的T分期(P=0.037)和TNM分期(P=0.004)呈负相关。Kaplan-Meier曲线和log-rank检验结果提示miR-146a-5p的低表达水平预示着较差的总生存率(overall survival,OS)(P = 0.017)和无进展生存率(Progression-free survival,PFS)(P = 0.004),多因素分析提示miR-146a-5p是ESCC患者OS(P=0.022)和PFS(P=0.004)的独立预后预测指标。食管鳞癌患者血清miR-146a-5p的水平比正常人的低(发现组:0.69±0.41 vs 1.79±0.85,P<0.001;验证组:0.57±0.29 vs 1.49±0.56,P<0.001),在发现组中ROC曲线下面积(Area under the curve of ROC,AUC)、敏感性和特异性分别为0.863±0.033、85.7%和68.6%,在验证组中分别为0.891±0.027、82.1%和83.3%。结论miR-146a-5p在ESCC肿瘤组织和患者血清中均明显下调,组织miR-146a-5p的表达水平可以作为ESCC的独立预后预测指标;血清miR-146a-5p作为ESCC的诊断指标,具有较高的敏感性和特异性。第二部分Notch2在食管鳞癌组织中的表达及其预后预测价值背景靶向治疗是肿瘤治疗领域的重大突破,靶向药物特异地结合并杀死肿瘤细胞,降低了对正常组织的副作用。食管癌靶向治疗的临床研究正在大量开展,然而目前的机制研究和临床实验效果不甚理想,针对已有靶点探索新的靶向药物或发掘新的食管癌治疗靶点有重要的临床应用价值。Notch信号通路在胚胎生长、细胞增殖和凋亡、干性维持和分化等过程中发挥了重要作用,在食管癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、非小细胞肺癌和宫颈癌等肿瘤的发生发展中也扮演了重要角色。研究发现,Notch1高表达水平与食管腺癌的分化、分期和淋巴结转移呈正相关,通过γ-分泌酶抑制剂(Gamma-secretase inhibitor,GSI)抑制Notch活性可以增强食管腺癌的化疗敏感性。Notch2在肺癌、胶质瘤、宫颈癌、肝癌、胃癌等肿瘤组织中呈高表达趋势,可以发挥促癌作用,然而在膀胱癌、乳腺癌和结直肠癌等肿瘤中表达下调,发挥抑癌作用,这一现象提示Notch2在肿瘤中的调控机制具有多样性。全基因组和外显子测序分析揭示了食管癌组织中Notch信号分子存在突变,包括Notch2基因的突变,然而Notch2蛋白在ESCC组织的表达水平和临床价值尚未见报道,本研究拟探讨ESCC组织中Notch2蛋白的表达水平及其预后价值,并揭示Notch2在ESCC细胞增殖和生存中的作用,为ESCC提供新的临床治疗策略。方法我们采用 qPCR、免疫组化(Immunohistochemical staining,IHC)和 western blot等方法,探讨ESCC组织中Notch2 mRNA和蛋白的表达情况,采用log-rank检验和多因素生存分析评价其预后预测价值,并采用CCK-8和克隆形成实验探讨敲除Notch2是否可以抑制ESCC细胞的增殖和克隆形成能力。结果与癌旁正常组织相比,ESCC肿瘤组织Notch2的mRNA和蛋白水平均明显上调(qPCR:P<0.0001;IHC:P = 0.004;WB:P=0.021)。Log-rank 检验提示 Notch2的高表达水平与ESCC患者较差的OS和PFS密切相关(OS:29.1%vs.49.1%,P=0.013;PFS:15.3%vs.34.4%,P = 0.006),多因素分析提示Notch2 可以作为ESCC 患者 OS(HR(95%CI):2.266(1.367-3.756),P = 0.002)和 PFS(HR(95%CI):2.160(1.374-3.396),P = 0.006)的独立预测指标。体外实验结果提示,与对照组相比,shRNA-Notch2组细胞的48h和72h的OD450值明显降低;抑制Notch2表达后,ESCC细胞克隆形成率也显著下降(所有P<0.0001)。结论ESCC组织中的Notch2 mRNA和蛋白表达水平均明显上调,Notch2蛋白高表达水平提示患者预后较差,可以作为预后预测指标。下调Notch2的表达水平可抑制ESCC细胞的增殖和克隆形成能力,提示Notch2在ESCC细胞增殖中发挥了重要作用,该研究可为ESCC临床治疗提供新的靶点。第三部分miR-146a-5p靶向Notch2调控食管鳞癌的上皮间质转化背景肿瘤转移是食管癌患者治疗失败的主要原因,探索食管癌转移的机制、发掘新的治疗靶点对于改善治疗效果有重要价值。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在肿瘤转移中扮演了重要角色,发生 EMT 的肿瘤细胞失去了上皮细胞极性,出现间质细胞的特征,细胞游动和迁移能力增加,促进了肿瘤的侵袭和转移。miRNAs是小片段非编码RNA分子,通过靶向结合和清除mRNA或抑制蛋白翻译过程进而抑制靶基因的表达。研究表明,miRNAs在肿瘤EMT进程中发挥了重要作用,比如,miR-630通过靶向作用于Wnt/betacatenin通路抑制胃癌EMT,miR-514a-3p则通过靶向EGFR抑制肾透明细胞癌的EMT进程。miR-146a-5p在肿瘤EMT调控中也有重要作用,miR-146a-5p可以通过抑制胰岛素受体底物2抑制非小细胞肺癌的EMT进程;发生远处转移的结直肠癌组织较原发组织的miR-146a-5p的表达量明显降低,提示miR-146a-5p与肿瘤转移密切相关。我们前期研究发现miR-146a-5p在ESCC组织和患者血清中低表达,可以作为较好的预后和诊断指标。Notch信号通路在EMT进程也发挥了重要作用,诱导肿瘤细胞EMT发生后,可检测到Notch2表达水平增高;相应的,抑制Notch2的表达可逆转EMT进程,下调Vimentin、E盒结合锌指蛋白 1(Zinc Finger E-box binding homeobox-boxl,ZEB1)、Slug 和 Snail 等间质性蛋白的表达,并降低肿瘤细胞的侵袭能力。我们的前期研究表明,Notch2在ESCC组织高表达,可以作为患者预后的独立预测指标,体外实验揭示了 Notch2的促癌作用,干扰Notch2蛋白表达可以抑制ESCC细胞的增殖和克隆形成能力,然而Notch2在ESCCEMT进程中的调控机制有待于进一步探索。靶基因预测系统提示,miR-146a-5p可以结合Notch2的3’-UTR区域,据此,本研究继续探讨miR-146a-5p和Notch2参与ESCC侵袭转移的调控机制,或可为ESCC的临床治疗提供新的策略。方法我们采用Transwell侵袭实验、qPCR和western blot等实验方法分别探讨miR-146a-5p和Notch2在EMT进程中的作用,靶基因预测系统和双荧光素酶报告用于验证miR-146a-5p对Notch2的靶向调控作用。结果miR-146a-5p mimics转染后穿过Transwell小室的ESCC细胞数量明显下降(EC9706:86.00±3.74vs 198.33±5.44,P<0.001;Eca109:73.33±2.87vs 153.00±5.72,P<0.001),miR-146a-5p inhibitor 转染组穿过 Transwell 小室的 ESCC 细胞数量明显增多(EC9706:417.00±12.83 vs 198.33±5.44,P<0.001;Eca109:358.67±10.66vs 153.00±5.72,P<0.001)。在 miR-146a-5pmimics 组中,E-cadherin 的表达上调(EC 9706:P=0.002;Eca109:P=0.001),而 Snail(EC9706:P=0.004;Eca109:P=0.001)和 Vimentin(EC9706:P=0.003;Eca109:P=0.001)蛋白表达水平明显下降。相应的,miR-146a-5p inhibitor转染组中,可检测到E-cadherin表达水平下降(EC 9706:P = 0.007;Eca109:P<0.001),而 Snail(EC 9706:P=0.005;Eca109:P=0.017)和 Vimentin(EC 9706:P<0.001;Eca 109:P<0.001)蛋白表达水平明显上调。miRNA靶基因预测系统提示Notch2的3’UTR区存在miR-146a-5p的结合位点,双荧光素酶报告表明,miR-146a-5p mimics抑制野生型Notch2 3’-UTR转染组的荧光值(EC9706:0.49±0.07 vs 1.04±0.12,P= 0.003;Eca109:0.51±0.02 vs 1.01±0.02,P<0.001),miR-146a-5p inhibitor 可上调野生型 Notch2 3’-UTR 转染组的荧光值(EC9706:1.63±0.09vs 1.04±0.12,P = 0.002;Eca109:1.51±0.02 vs 1.01±0.02,P<0.001),而对 Notch2 3’-UTR 突变组没有影响(所有 P>0.05)。shRNA-Notch2转染可以抑制 Tranwell 侵袭细胞数量(EC9706:66.33±5.31 vs 153.00±9.20,P<0.001;Eca109:55.33±7.85vs166.00±10.42,P<0.001),使 Snail 和 Vimentin(所有P<0.001)蛋白表达水平下降,E-cadherin蛋白表达水平上调(EC 9706:P<0.001;Eca109:P=0.002)。更重要的是,shRNA-Notch2 可以削弱 miR-146a-5pinhibitor对ESCC细胞侵袭能力和EMT进程的促进作用(anti-miR-146a-5p+anti-Notch2组vs anti-miR-146a-5p+Notch2-NC 组:EC 9706:Transwell,179.33±7.76 vs 404.00±12.57,P<0.001;Snail,P<0.001;Vimentin,P<0.001;E-cadherin,P=0.002;Eca109:Transwell,111.33±9.84 vs 249.67±15.92,P<0.001;Snail,P<0.001;Vimentin,P=0.002;E-cadherin,P=0.003)。结论miR-146a-5p可以靶向抑制Notch2表达,进而抑制ESCC的EMT进程,发挥抑癌基因的作用,为食管癌的治疗开辟了新的策略。