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microRNA(miRNA)是一类长约22个核苷酸的非编码的单链RNA分子，可通过引发靶mRNA的降解或/和翻译抑制来介导转录后基因沉默。这类小分子RNA经常以组织特异性或发育时期特异性的方式表达，在调节组织/细胞的生长、发育、分化、凋亡和功能等方面起了重要的作用。miRNA广泛存在于多细胞生物中。根据计算机预测，在哺乳动物中miRNA种类总数估计可达1000以上。然而，现在哺乳动物中经实验鉴定的miRNA为700余种，其中绝大部分都是在系统进化上高度保守。最近的研究已表明在高等生物中存在着大量非保守的miRNA。因此，继续开展新的miRNA的实验鉴定及其功能研究具有重要的意义。
本论文研究以成年大鼠为模式，建立哺乳动物miRNA研究的平台。通过分离了成年大鼠的不同组织中大约22核苷酸左右的小分子RNA，构建了小分子RNA的cDNA文库。该文库有效地排除了细胞中rRNA和tRNA的干扰，文库中miRNA的克隆比率高达65％，且很多miRNA家族的多个成员都被检测到。无论是在miRNA的丰度还是种类的多样性方面，本论文研究构建的cDNA文库都已经达到国际同类研究的先进水平。
通过对文库的测序和筛选，我们从2000多个克隆子中共鉴定了135个不同的miRNA。这135种不同的miRNA分子中，104种与已知大鼠miRNA匹配，覆盖了miRBase(8.0版本)(http：//microrna.sanger.ac.uk/cgi-bin/sequences)注册的大鼠miRNA(234)的44％；16种miRNA未在大鼠miRbase中注册；15种是最新鉴定的miRNA。大部分新的miRNA在系统进化上的保守度很低。对新的miRNA在脑、心脏、睾丸等7种组织中的表达谱分析表明，除了一个非保守的miRNA(暂时命名为miR-665)在鼠类的7种组织中都有表达外，其余的10种miRNA呈现组织特异性/限制性表达。
通过对新miRNA的基因座位和组织形式的分析发现，三个睾丸特异的新miRNA基因位于大鼠X染色体上相距小于15kb，组成了一个只在鼠类中高度保守的miRNA基因簇。还有一个新miRNA和一个已知的H/ACAboxsnoRNA(RBI-36)由脑特异的5-羟色胺2C受体基因(5-serotonin2Creceptorgene)的同一个内含子编码，构成了一个内含子基因簇。而且它们的基因座位在小鼠和人类中都高度保守。这是目前首次发现的保守的内含子miRNA+snoRNA基因簇。这种基因组织形式表明内含子可以编码多种非编码RNA等功能元件，同时也意味着miRNA、snoRNA、mRNA的共表达、共调控和可能的协同功能网络。
miR-665在大鼠7种组织中的均一性表达引起了我们的注意，进一步的序列分析发现其与大鼠基因组完全匹配的基因位点紧邻于tRNAArg的3末端。这个tRNAArg基因包含了PolⅢ转录所必须的启动子和终止子，意味着miR-665可能与tRNAArg基因一起表达。RT-PCR结果验证了miR-665与tRNAArg的共转录。二级结构预测显示miR-665与其下游序列能被折叠成一个短的茎环结构，miR-665位于茎环的5臂上。tRNAArg-miR-665基因只在小鼠中高度保守，且在小鼠多种组织中表达，进一步证实了tRNA-miR-665基因的存在。该基因的双顺反子转录前体可能由RNaseZ加工成miRNA前体和tRNA。显然，这是一种新的哺乳动物miRNA生物合成途径。PolⅢ转录的miRNA以前仅在小鼠γ-疱疹病毒68(mousegammaherpesvirus，MHV68)中被发现，推测可能与该病毒侵染宿主各类细胞的能力相关。那么哺乳动物中组成型表达的miRNA在细胞中起什么作用呢?有趣的是，miR-665的一个预测的靶基因编码MHV68中的单链DNA结合蛋白。PolⅢ转录的miRNA的发现及其组成型表达可能揭开哺乳动物miRNA在细胞中新的调控功能。
除了在基因组织形式方面的特征，几种新的miRNA被发现位于疾病相关的基因位点，靶基因预测结果显示大部分新的miRNA的靶基因与疾病特别是肿瘤有密切的关系，这些结果都进一步提示miRNA介导的基因表达调控在疾病发生中的作用。