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寄生蜂种类繁多、寄主范围广,是一类重要害虫天敌资源。蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum是菜青虫Pieris rapae等蝶类蛹期优势寄生蜂,在农田生态系统中发挥有重要的自然控制作用。为了探明miRNA在蝶蛹金小蜂中的作用,本论文就该蜂miRNA生物合成通路以及miRNA进行了鉴定,进而对卵巢、脂肪体内潜在蜕皮激素受体EcR、保幼激素受体Met应答的miRNA进行了鉴定分析,以明确激素与miRNA协同参与卵巢发育的机制。主要研究结果如下:1.蝶蛹金小蜂miRNA、siRNA生物合成通路注释结合基因组与转录组,对蝶蛹金小蜂中miRNA生物合成通路基因Drosha、Pasha、Exportin-5、Dicer-1、Loquacious、Argonaute-1以及 siRNA 通路中基因Dicer-2、R2D2、Argonaute-2和Sid1进行注释。最终在蝶蛹金小蜂基因组中注释到以上所有基因,其中R2D2和Ago-2分别有2个和3个拷贝,其余基因均只有1个拷贝。对膜翅目昆虫Dicer和Argonaute基因系统发育分析表明,siRNA通路有关基因蛋白进化速度明显更快。表达谱分析显示miRNA通路基因在蝶蛹金小蜂成虫期有较高表达,而siRNA通路基因在不同发育阶段表达模式不一致。2蝶蛹金小蜂miRNA的鉴定及分析构建了 8个不同发育阶段、性别的小RNA文库,从中鉴定到75个保守miRNA基因、119个非保守miRNA基因,共编码254个miRNA成熟体。其中88个miRNA位于26个miRNA簇中。差异表达分析鉴定到84个胚胎、幼虫期差异表达miRNA,20个幼虫、蛹期差异表达miRNA,26个蛹、成虫期差异表达miRNA。鉴定到在不同性别胚胎(10个)、幼虫(29个)、蛹(8个)和成虫(14个)间差异表达miRNA。此外,通过生物信息学预测并比较15种膜翅目昆虫miRNA基因的构成,结果表明miR-87、miR-306在小蜂总科丢失,miR-316在小蜂总科和茧蜂中丢失。3 RNA干扰PpEcR、PpMet后卵巢、脂肪体中miRNA表达分析RNA干扰Argonaute-1(PpAgo1)、PpEcR、PpMet后蝶蛹金小蜂卵巢卵黄沉积变少,成熟卵少或没有。荧光定量PCR结果表明蝶蛹金小蜂脂肪体中Vitellogenin-1(PpVg1)表达量受 PpEcR影响,而 Vitellogenin-2(PpVg2)受 PpMet影响,但影响程度不大,且在不同时期变化趋势相反。卵巢中Vitellogenin receptor(Pp VgR)表达不受PpEcR、PpMet影响。对RNA干扰后的黑蛹期、羽化后24h、羽化后48h雌蜂脂肪体、卵巢中miRNA进行定量分析,最终在卵巢、脂肪体中分别鉴定到54、43个表达量显著变化的miRNA。在卵巢中,干扰PpMet后let-7-C簇miRNA表达上调,而miR-3791-318簇miRNA表达下调,干扰PpEcR后miR-2-71簇miRNA表达上调。在脂肪体中,干扰PpMet后miR-275-305簇、miR-2-71簇miRNA表达上调,干扰PpEcR后miR-2-71簇表达下调。4蝶蛹金小蜂miR-3791-318基因簇分析miR-3791-318 基因簇包含 miR-3791、miR-279c、miR-9b、miR-2944 以及miR-318共5个miRNA基因。序列比对结果显示5个miRNA基因3p端成熟体在物种间更为保守。荧光定量PCR结果表明该基因簇miRNA在卵巢中高表达,且表达量随着羽化逐渐增加并在羽化后48 h达到高峰。在RNA干扰PpMet后的雌蜂卵巢中,发现该簇miRNA表达量显著下降。对该簇启动子区域进行分析,在转录起始位点附近鉴定到3个保守的E-box,是PpMet潜在结合位点。同时,通过JASPAR在启动子区域附近预测到5个E74结合位点,通过特异性RNA干扰蝶蛹金小蜂E74两个剪切体,发现在干扰PpE74A后的雌蜂卵巢中,该基因簇miRNA成熟体表达量显著下调,而干扰PpE74B并无影响,表明miR-3791-318基因簇表达可能同时受蜕皮激素调控。对该基因簇3p端miRNA成熟体进行靶标预测和富集分析,在Wnt通路上预测到5个miR-3791-3p潜在作用靶标,通过活体注射确认CtBP mRNA水平在miR-3791-3p过表达后发生下调。表明miR-3791-3p可能通过作用Wnt通路在卵巢发育等生理过程中发挥作用。5作用于PpMet的miRNA鉴定与分析使用miRanda、TargetScan以及PITA三个软件预测可能作用PpMet的3’UTR的 miRNA,最终得到 12 个候选 miRNA:miR-2c-5p、miR-14-3p、miR-92a-3p、miR-252-5p、miR-275-3p、miR-279b-3p、miR-307-3p、miR-927b-3p、miR-996-5p、miR-3477-3p、miR-6001-3p 和 let-7-3p。定量结果表明在注射 miR-996-5p 类似物后,PpMet在mRNA水平显著下调,而其余miRNA均无影响。注射所有miRNA类似物的均未影响卵巢发育。双荧光素酶实验结果表明12个miRNA未能作用所预测的结合位点。