【摘 要】
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研究目的:通过杂交瘤单克隆抗体技术制备抗五步蛇毒单克隆抗体,探索该技术制备高效价抗五步蛇毒单克隆抗体的可能,为研制抗蛇毒血清提供一定的实验数据和技术支撑。研究方法:一、抗五步蛇毒单克隆抗体的制备及纯化1.五步蛇毒免疫小鼠用定量五步蛇毒粗毒溶液作为抗原,与佐剂完全混合乳化后,通过腹部皮下多点注射免疫BALB/C小鼠。2.骨髓瘤细胞和脾细胞的融合采用双向免疫扩散法和间接ELISA法判断筛选出高效价的免
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研究目的:通过杂交瘤单克隆抗体技术制备抗五步蛇毒单克隆抗体,探索该技术制备高效价抗五步蛇毒单克隆抗体的可能,为研制抗蛇毒血清提供一定的实验数据和技术支撑。研究方法:一、抗五步蛇毒单克隆抗体的制备及纯化1.五步蛇毒免疫小鼠用定量五步蛇毒粗毒溶液作为抗原,与佐剂完全混合乳化后,通过腹部皮下多点注射免疫BALB/C小鼠。2.骨髓瘤细胞和脾细胞的融合采用双向免疫扩散法和间接ELISA法判断筛选出高效价的免疫小鼠血清。获取该免疫小鼠脾脏细胞,通过PEG诱导其与同源的骨髓瘤细胞融合来产生杂交瘤细胞。3.抗体细胞筛选通过HAT/HT选择性培养,筛选出融合成功的杂交瘤细胞,进一步通过间接ELISA法筛选出阳性融合细胞,最后经过亚克隆得到目的细胞株。4.抗五步蛇毒单克隆抗体制备及纯化液体石蜡/弗氏不完全佐剂致敏BALB/C小鼠,通过腹腔注射杂交瘤阳性细胞株（每只小鼠注射约10~5个细胞）诱生腹水来制备抗五步蛇毒单克隆抗体。采用protein G亲和层析法来纯化抗五步蛇毒单克隆抗体。5.抗五步蛇毒单克隆抗体纯度鉴定通过SDS-PAGE鉴定抗五步蛇毒单克隆抗体纯度。二、抗五步蛇毒单克隆抗体的活性鉴定1.采用间接ELISA法测定其抗体效价。2.采用间接ELISA法检测其抗体亚型。3.通过蛋白免疫印迹法（Western Blotting,WB）和试管凝集试验测定抗五步蛇毒单克隆抗体与五步蛇毒特异性结合能力。4.通过中和实验检测五步蛇毒单克隆抗体对五步蛇毒急性毒性的影响,判定其对五步蛇毒的中和减毒活性。5.通过体内保护实验分别检测五步蛇毒单克隆抗体对五步蛇毒最小全致死剂量的影响和对不同剂量五步蛇毒毒性的影响,观察其对五步蛇毒中毒小鼠的治疗作用。研究结果:1.小鼠经三次免疫,一次加强免疫后,测得免疫小鼠血清抗五步蛇毒抗体的效价高于500000,且其在双向免疫扩散实验中与五步蛇毒有多条沉淀线。2.获得G2B5、4G5、2H10三株抗五步蛇毒单克隆抗体杂交瘤细胞株。3.经检测,三株杂交瘤细胞株所产抗五步蛇毒单克隆抗体亚型均为Ig G1。4.成功纯化G2B5抗五步蛇毒单克隆抗体。5.经检测,抗五步蛇毒单克隆抗体G2B5细胞株的最高效价为1280000。6.中和实验结果显示抗五步蛇单克隆抗体（G2B5）可以部分中和五步蛇毒,并且使五步蛇毒对小鼠的LD50从5.60mg/kg上升至6.47mg/kg。7.抗五步蛇毒单克隆抗体（G2B5）对五步蛇毒中毒小鼠有一定的治疗作用,可以一定程度上对抗五步蛇毒毒性。抗五步蛇毒单克隆抗体（G2B5）可以显著延长五步蛇毒100%死亡最小剂量中毒小鼠存活时间:中毒小鼠存活时间均超过3小时,其中两只小鼠存活超过72小时,而PBS组小鼠在2小时内全部死亡。此外,在不同剂量五步蛇毒染毒小鼠,五步蛇毒单抗保护染毒小鼠2小时内不死亡。结论:应用杂交瘤单克隆抗体技术可以成功获得三株产抗五步蛇毒单克隆抗体细胞株,制备了具有中和减毒作用的抗五步蛇毒单克隆抗体,这些抗体亚型均为Ig G1。
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