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目的：
应用杂交瘤技术，制备抗眼镜蛇毒的单克隆抗体，为抗蛇血清的制备提供新的生产方法，解决抗蛇毒血清短缺问题，为蛇伤救治提供帮助。
方法：
一.免疫小鼠
用定量的眼镜蛇毒（Naja naja atra Venom NAV）溶液作为抗原，与佐剂完全混合并乳化后，通过皮下多点注射免疫balbc小鼠。
二.细胞融合
提取免疫小鼠血浆，采用间接ELISA法测定并筛选出效价高的免疫小鼠血浆。分离出该免疫小鼠的脾脏，获得致敏B细胞。利用PEG的作用将其与同源的SP2/O骨髓瘤细胞进行融合，产生具有两者特性即能产生抗体又能不断生长的杂交瘤细胞。
三.细胞筛选
以HAT、HT培养基选择培养杂交瘤细胞，去除非杂交瘤细胞。以间接ELISA法测定不同杂交瘤细胞上清反应性，筛选出强阳性的杂交瘤细胞，然后利用有限稀释法制备单克隆细胞株。根据该杂交瘤细胞所处的96孔板的位置命名所获得的强阳性杂交瘤细胞。
四.抗体制备
将产生的单克隆细胞培养至106个/ml后，接种于提前给予液体石蜡的小鼠腹腔，产生含有高效价的单克隆抗体的腹水并命名为抗眼镜蛇毒腹水（anti-cobra venom ascitesACA）。
五.活性鉴定
1．以间接ELISA法检测ACA，确定其抗体效价。
2．利用不同的亚型抗体与ACA反应性的差别，采用间接ELISA法检测ACA的抗体亚型。
3．应用竞争ELISA法检测ACA的结合能力，确定其的亲和力。
4．以间接ELISA和双向免疫扩散实验检测不同蛇毒和ACA的反应性，确定ACA的种属特异性及其与特异抗原的结合能力。
5．用间接ELISA和双向免疫扩散实验检测ACA和NAV主要毒性成分的结合反应能力，初步观察ACA的减毒机制。
6．用中和实验检测ACA对NAV急性毒性的影响，确定其对NAV的中和活性。
7．用体内保护实验检测ACA对NAV急性毒性的影响，观察其对NAV中毒小鼠的治疗作用。
8．用中和实验检测ACA对眼镜王蛇毒急性毒性的影响，观察其对眼镜王蛇毒的中和活性，了解ACA对眼镜蛇科蛇毒的交叉反应。
结果：
一.建立一株产抗眼镜蛇毒抗体的杂交瘤细胞株BE12B5
本研究经免疫小鼠、细胞融合、细胞筛选等实验流程，筛选出一株稳定性好、分泌能力强的杂交瘤细胞株BE12B5，并制备出了高效价的抗眼镜蛇毒腹水（ACA）。
二.抗眼镜蛇毒抗体的部分生物学表征
经检测，BE12B5细胞株上清的抗体效价可达1024，抗体亚型为lgG1，ACA效价大于400万，亲和力常数为2.0×10-7L/mol。一般认为亲和力常数在10-8~10-11L/mol内的单克隆抗体为高亲和力，ACA具有较高的亲和力。
三.ACA的种属特异性
间接ELISA和双向免疫扩散实验发现ACA不仅对NAV有特异性的结合反应，对眼镜王蛇毒亦具有较强的特异性结合反应，它们的结合能力和对照组比较具有统计学差异（P＜0.0001）。ACA对银环蛇毒、蝮蛇毒、蝰蛇毒、五步蛇毒则无特异性结合反应，它们的结合能力和对照组比较无统计学差异（P＞0.05）。
四.ACA体外与NAV混合对眼镜蛇毒毒性的影响
在体外中和实验中，发现10ul（很低剂量）ACA与不同浓度的NAV混合后腹腔注射，能使NAV中毒小鼠死亡率降低，存活时间延长。NAV的LD50由1.623mg/kg上升至1.903mg/kg。以中和效价ED50作为所得抗眼镜蛇毒抗体的活性指标，计算ACA保护50%小鼠不死亡的每毫升抗蛇毒单抗所能中和的蛇毒质量ACA的中和效价ED50值为3.806mg/ml，95%可信区间为3.592~4.028mg/ml。
五.ACA对NAV中毒小鼠的治疗作用
在体内保护性实验中，10ul ACA腹腔注射使NAV中毒小鼠死亡率降低，小鼠的存活时间延长，眼镜蛇毒的LD50由1.623mg/kg上升至1.809mg/kg。ACA对NAV的治疗效价ED50值为3.618mg/ml，95%可信区间为3.302~3.958mg/ml。
六.ACA对眼镜王蛇毒毒性影响
在体外中和实验中，10ul ACA与不同浓度眼镜王蛇毒混合后腹腔注射，可使眼镜王蛇毒中毒小鼠的LD50值由0.568mg/kg上升至0.695mg/kg，由此推算ACA对眼镜王蛇毒中和效价ED50为1.390mg/ml，95%可信区间为1.234~2.016mg/ml。
结论：
本研究成功制备了一株稳定性好的眼镜蛇毒单克隆抗体细胞株BE12B5，并制备出了高效价的ACA。ACA为特异性抗眼镜蛇毒单抗，具有较高的亲和力，且它和NAV及其所含主要毒性成分─心脏毒素均具有强的反应性。在体外可以中和眼镜蛇毒，降低其毒性；在体内具有减毒作用，对于NAV中毒小鼠具有治疗作用，ACA对眼镜王蛇毒具有一定的交叉中和作用，亦能降低其毒性。
应用杂交瘤技术，制备抗眼镜蛇毒的单克隆抗体，为抗蛇血清的制备提供新的生产方法，解决抗蛇毒血清短缺问题，为蛇伤救治提供帮助。
方法：
一.免疫小鼠
用定量的眼镜蛇毒（Naja naja atra Venom NAV）溶液作为抗原，与佐剂完全混合并乳化后，通过皮下多点注射免疫balbc小鼠。
二.细胞融合
提取免疫小鼠血浆，采用间接ELISA法测定并筛选出效价高的免疫小鼠血浆。分离出该免疫小鼠的脾脏，获得致敏B细胞。利用PEG的作用将其与同源的SP2/O骨髓瘤细胞进行融合，产生具有两者特性即能产生抗体又能不断生长的杂交瘤细胞。
三.细胞筛选
以HAT、HT培养基选择培养杂交瘤细胞，去除非杂交瘤细胞。以间接ELISA法测定不同杂交瘤细胞上清反应性，筛选出强阳性的杂交瘤细胞，然后利用有限稀释法制备单克隆细胞株。根据该杂交瘤细胞所处的96孔板的位置命名所获得的强阳性杂交瘤细胞。
四.抗体制备
将产生的单克隆细胞培养至106个/ml后，接种于提前给予液体石蜡的小鼠腹腔，产生含有高效价的单克隆抗体的腹水并命名为抗眼镜蛇毒腹水（anti-cobra venom ascitesACA）。
五.活性鉴定
1．以间接ELISA法检测ACA，确定其抗体效价。
2．利用不同的亚型抗体与ACA反应性的差别，采用间接ELISA法检测ACA的抗体亚型。
3．应用竞争ELISA法检测ACA的结合能力，确定其的亲和力。
4．以间接ELISA和双向免疫扩散实验检测不同蛇毒和ACA的反应性，确定ACA的种属特异性及其与特异抗原的结合能力。
5．用间接ELISA和双向免疫扩散实验检测ACA和NAV主要毒性成分的结合反应能力，初步观察ACA的减毒机制。
6．用中和实验检测ACA对NAV急性毒性的影响，确定其对NAV的中和活性。
7．用体内保护实验检测ACA对NAV急性毒性的影响，观察其对NAV中毒小鼠的治疗作用。
8．用中和实验检测ACA对眼镜王蛇毒急性毒性的影响，观察其对眼镜王蛇毒的中和活性，了解ACA对眼镜蛇科蛇毒的交叉反应。
结果：
一.建立一株产抗眼镜蛇毒抗体的杂交瘤细胞株BE12B5
本研究经免疫小鼠、细胞融合、细胞筛选等实验流程，筛选出一株稳定性好、分泌能力强的杂交瘤细胞株BE12B5，并制备出了高效价的抗眼镜蛇毒腹水（ACA）。
二.抗眼镜蛇毒抗体的部分生物学表征
经检测，BE12B5细胞株上清的抗体效价可达1024，抗体亚型为lgG1，ACA效价大于400万，亲和力常数为2.0×10-7L/mol。一般认为亲和力常数在10-8~10-11L/mol内的单克隆抗体为高亲和力，ACA具有较高的亲和力。
三.ACA的种属特异性
间接ELISA和双向免疫扩散实验发现ACA不仅对NAV有特异性的结合反应，对眼镜王蛇毒亦具有较强的特异性结合反应，它们的结合能力和对照组比较具有统计学差异（P＜0.0001）。ACA对银环蛇毒、蝮蛇毒、蝰蛇毒、五步蛇毒则无特异性结合反应，它们的结合能力和对照组比较无统计学差异（P＞0.05）。
四.ACA体外与NAV混合对眼镜蛇毒毒性的影响
在体外中和实验中，发现10ul（很低剂量）ACA与不同浓度的NAV混合后腹腔注射，能使NAV中毒小鼠死亡率降低，存活时间延长。NAV的LD50由1.623mg/kg上升至1.903mg/kg。以中和效价ED50作为所得抗眼镜蛇毒抗体的活性指标，计算ACA保护50%小鼠不死亡的每毫升抗蛇毒单抗所能中和的蛇毒质量ACA的中和效价ED50值为3.806mg/ml，95%可信区间为3.592~4.028mg/ml。
五.ACA对NAV中毒小鼠的治疗作用
在体内保护性实验中，10ul ACA腹腔注射使NAV中毒小鼠死亡率降低，小鼠的存活时间延长，眼镜蛇毒的LD50由1.623mg/kg上升至1.809mg/kg。ACA对NAV的治疗效价ED50值为3.618mg/ml，95%可信区间为3.302~3.958mg/ml。
六.ACA对眼镜王蛇毒毒性影响
在体外中和实验中，10ul ACA与不同浓度眼镜王蛇毒混合后腹腔注射，可使眼镜王蛇毒中毒小鼠的LD50值由0.568mg/kg上升至0.695mg/kg，由此推算ACA对眼镜王蛇毒中和效价ED50为1.390mg/ml，95%可信区间为1.234~2.016mg/ml。
结论：
本研究成功制备了一株稳定性好的眼镜蛇毒单克隆抗体细胞株BE12B5，并制备出了高效价的ACA。ACA为特异性抗眼镜蛇毒单抗，具有较高的亲和力，且它和NAV及其所含主要毒性成分─心脏毒素均具有强的反应性。在体外可以中和眼镜蛇毒，降低其毒性；在体内具有减毒作用，对于NAV中毒小鼠具有治疗作用，ACA对眼镜王蛇毒具有一定的交叉中和作用，亦能降低其毒性。