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马度米星铵（maduramicinammonium,MA）是一种聚醚类离子载体抗生素,常作为饲料添加剂用于预防和治疗家禽球虫病。但马度米星铵的毒性剂量和添加剂量接近,常因使用不当导致中毒,带来不小的经济损失。此外由于马度米星铵残留在食品动物体内或大量以原形被排泄进入环境从而引起人类中毒甚至死亡。本课题组前期研究发现,在C2C12小鼠成肌细胞、L6大鼠成肌细胞、小鼠骨骼肌组织和/或肉鸡骨骼肌组织中,马度米星铵可以将细胞周期阻滞在G0/G1期从而抑制细胞增殖;诱导细胞和组织活性氧生成,通过PP5-JNK通路引发细胞凋亡;还会激活AMPK、引起内质网应激、诱导自噬发生并阻断自噬流。为进一步研究马度米星铵引起的AMPK激活、内质网应激与自噬的关系,本研究采用L6和C2C12骨骼肌成肌细胞系和Wistar大鼠模型作为体内外模型,通过马度米星铵和/或ISRIB、siRNA处理,检测细胞增殖、细胞内钠离子浓度及Na+/K+-ATPase、AMPK、自噬与内质网应激相关蛋白表达和磷酸化,研究马度米星铵对骨骼肌毒性作用机制,探讨AMPK、内质网应激、自噬相关信号传导通路在马度米星铵引起毒性中的作用,为预防和治疗马度米星铵中毒提供理论依据。在体外L6和C2C12细胞试验中,浓度-效应试验采用0、0.5、1.0、2.0 μM马度米星铵处理10 h;时间-效应试验采用1.0 μM马度米星铵处理0、1、2、4、8、12 h;利用荧光探针标记结合流式细胞术检测细胞内钠离子浓度,Western blot检测Na+/K+-ATPase和自噬相关蛋白表达;结果表明0.5～2.0 μM马度米星铵处理10 h显著增加细胞内钠离子浓度,显著上调Na+/K+-ATPase和p62、LC3-II表达;1.0μM马度米星铵处理1～12 h,LC3-II蛋白表达均显著上调,Na+/K+-ATPase和p62蛋白在处理8 h后表达显著上调。Wistar大鼠体内剂量效应试验分为空白对照组、1.75 mg/kgb.w.马度米星铵、3.50mg/kgb.w.马度米星铵、7.00mg/kgb.w.马度米星铵灌胃组,灌胃7天后取股直肌,Western blot 检测 Na+/K+-ATPase、p62 和 LC3 蛋白表达;结果表明 7.00 mg/kg b.w.马度米星铵灌胃组大鼠股直肌组织中Na+/K+-ATPase、p62和LC3-II蛋白表达量均显著增加。体外细胞浓度/时间-效应试验和大鼠体内剂量-效应试验分组如上,Western blot检测细胞和组织中eIF2α和ATF4蛋白表达;结果表明,0.5～2.0 μM马度米星铵处理10h显著上调eIF2α蛋白磷酸化水平和ATF4蛋白表达;1.0 μM马度米星铵处理1～12 h后,eIF2α和ATF4蛋白表达均显著上调;1.75～7.00 mg/kg b.w.马度米星铵灌胃7天后大鼠股直肌组织中eIF2α蛋白磷酸化水平和ATF4蛋白表达显著增加。马度米星铵联合ISRIB处理试验分组如下:对照组、ISRIB处理组、马度米星铵处理组、共处理组,MTT法检测细胞活性,Western blot检测ATF4、p62和LC3蛋白表达;结果表明,马度米星铵和ISRIB共处理组与马度米星铵处理组相比,ATF4、p62、LC3-II蛋白表达显著降低,细胞活性显著上升。体外细胞浓度/时间-效应试验和大鼠体内剂量-效应试验分组如前,Western blot检测细胞和组织内AMPK蛋白表达及其磷酸化水平;结果表明,0.5～2.0 μM马度米星铵处理显著增加AMPK蛋白磷酸化水平;1.0 μM马度米星铵处理1～12 h后,AMPK蛋白磷酸化水平显著增加;1.75～7.00mg/kg b.w.马度米星铵灌胃7天后大鼠股直肌组织中AMPK蛋白磷酸化水平显著增加。RNA干扰试验分组如下:NC siRNA转染组、AMPKα2 siRNA转染组、NC siRNA转染后马度米星铵处理组、AMPKα2 siRNA转染后马度米星铵处理组;通过Western blot检测AMPK、eIF2α、ATF4和自噬相关蛋白表达,EdU法检测细胞增殖;结果表明,转染AMPKα2 siRNA后马度米星铵处理组与转染NC siRNA后马度米星铵处理组相比,AMPK和eIF2α蛋白磷酸化水平显著降低,ATF4、LC3-II蛋白表达显著降低,细胞增殖能力显著增加。综上所述,马度米星铵可提升L6和C2C12细胞内钠离子浓度和成肌细胞与骨骼肌组织中Na+/K+-ATPase蛋白表达;马度米星铵活化AMPK从而激活内质网应激eIF2α-ATF4通路,进而阻断骨骼肌细胞内自噬流,最终抑制骨骼肌细胞生长增殖。以上结果提示,通过调控AMPK和内质网应激可削弱马度米星铵对骨骼肌成肌细胞和组织的损伤,为临床和生产中减轻马度米星毒性提供了新的思路,保障动物和人类健康。