【摘 要】
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绿豆（Vigna radiata）是一种营养价值和药用价值较高的经济作物,具有低脂肪、中淀粉、高蛋白的特点。绿豆蛋白的氨基酸种类全面,配比均衡,是一种优质的植物蛋白来源。生物活性肽在机体内有独特的吸收机制、致敏性低、无毒副作用,且具有抗氧化、降血压、免疫调节等多种生物活性,因此受到人们广泛的关注。本课题采用碱提酸沉的方法提取绿豆蛋白,利用酶解技术水解绿豆蛋白,通过单因素和响应面试验优化酶解参数,随
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绿豆（Vigna radiata）是一种营养价值和药用价值较高的经济作物,具有低脂肪、中淀粉、高蛋白的特点。绿豆蛋白的氨基酸种类全面,配比均衡,是一种优质的植物蛋白来源。生物活性肽在机体内有独特的吸收机制、致敏性低、无毒副作用,且具有抗氧化、降血压、免疫调节等多种生物活性,因此受到人们广泛的关注。本课题采用碱提酸沉的方法提取绿豆蛋白,利用酶解技术水解绿豆蛋白,通过单因素和响应面试验优化酶解参数,随后采用不同机理的体外化学抗氧化方法和H2O2诱导的HepG2细胞氧化损伤模型来评价绿豆肽（MBPs）的抗氧化活性,最后利用色谱技术对MBPs进行分离纯化,和质谱技术对目标组分进行结构鉴定,具体结果如下:（1）采用碱性蛋白酶Alcalase 2.4L FG酶解绿豆蛋白制备MBPs,以水解度（DH）为指标,利用优化试验研究底物质量浓度、酶解温度、pH值、酶用量及酶解时间等对DH的影响。Design Expert.V8.0.6.1软件确定绿豆蛋白的最优酶解工艺参数为:底物质量浓度为4.90%,pH值9.0,酶用量5.06%,酶解温度50℃,酶解时间4 h,所得水解度为30.24%。（2）制备的MBPs分子量小,含有高含量的碱性和疏水性氨基酸,且表现出一定的体外抗氧化能力。MBPs共有17种氨基酸,其中人体的8种必需氨基酸具有34.18%的占比,非极性氨基酸、极性氨基酸、碱性氨基酸和酸性氨基酸占比也分别为35.27%、11.91%、19.40%、33.43%。高效液相色谱显示MBPHs主要由分子量小于3000 Da的肽段组成（95.36%）,其中小于2000 Da的肽段的比例为85.98%。FI-TR图谱表明MBPs中含有二级结构中的α-螺旋和β-折叠结构,除此之外还有多种不饱和基团存在。体外自由基清除试验表明MBPs对DPPH和ABTS自由基的清除能力均较强,浓度为10.0 mg/mL和2.0 mg/mL时,清除率就分别达到60.47±4.41%和77.76±1.42%。（3）MBPs能够保护HepG2细胞免受H2O2诱导的氧化损伤。结果表明,MBPs对HepG2细胞无毒性,且与模型组相比,经过MBPs预保护的细胞存活率显著上升（P<0.01）。除此之外,MBPs能够显著降低HepG2细胞内ROS和MDA的含量,增加SOD的活性,从而具有保护HepG2细胞免受H2O2诱导氧化损伤的能力。（4）利用凝胶色谱（Sephadex G-25）和UPLC-Q-TOF-MS/MS对MBPs进行分离纯化和结构鉴定。结果显示,Sephadex G-25将MBPs共分离出6个组分:F1、F2、F3、F4、F5、F6,其中分子量最小的组分F6显示出最强的DPPH自由基清除的能力。组分F6通过质谱技术共被鉴定出8条肽段,其氨基酸序列分别为:Cys-Val-Val-Gly-Phe-His（846.37 Da）、Ala-Ser-Phe-Ala-Ser-Met-Pro-His（846.37Da）、Arg-Pro-Lys-Pro-Pro-His（730.42 Da）、Gly-Asn-Trp-Gly-Pro-Leu（642.3 Da）、Gln-Pro-Ala-Asn-Val-Phe（675.32 Da）、Ala-Pro-Ala-Pro-Ile-Tyr（630.33 Da）、Ala-Arg-Phe-Pro-Ala（560.31 Da）、Leu-Ala-Ala-Cys-Gly-Glu-Phe-His（846.37 Da）。8条肽段不仅分子量均小于1000 Da,且与抗氧化肽相关的疏水性和碱性氨基酸在肽段中的占比也较高。
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