【摘 要】
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氧氟沙星（Ofloxacin,OFL）是氟喹诺酮（Fluoroquinolones,FQs）的一种。FQs抗菌谱广,对革兰氏阴性菌和阳性菌都有抑制作用。OFL被广泛用于水产、畜牧等养殖业中,预防并治疗畜禽和鱼类感染性疾病。OFL在机体中不易降解,导致其在环境中富集并产生细菌耐药性的问题。2015年国家农业部发布公告禁止氧氟沙星等4类FQs抗生素在食用动物中的使用,然而一些企业仍然在水产养殖中违法添
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氧氟沙星（Ofloxacin,OFL）是氟喹诺酮（Fluoroquinolones,FQs）的一种。FQs抗菌谱广,对革兰氏阴性菌和阳性菌都有抑制作用。OFL被广泛用于水产、畜牧等养殖业中,预防并治疗畜禽和鱼类感染性疾病。OFL在机体中不易降解,导致其在环境中富集并产生细菌耐药性的问题。2015年国家农业部发布公告禁止氧氟沙星等4类FQs抗生素在食用动物中的使用,然而一些企业仍然在水产养殖中违法添加兽药,导致我国水产品中兽药残留不符合相关标准。免疫胶体金法（Colloidal Gold Immunochromatography,CGIC）有众多优点,诸如快速、简便、廉价、稳定性好且适用于检测多种样本,成为药物残留尤其是现场筛查的有效方法,可以将其应用于水产品中OFL残留的检测,保障水产品的食品安全。本研究通过碳二亚胺法合成氧氟沙星的免疫原及包被原,用OFL的免疫原免疫小鼠,选择检测效价高、抑制好的小鼠,将其脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,融合后的杂交瘤细胞通过三次“筛选-克隆”过程,共获得7E11-G2-C12-C9、8H6-G3-A1-B2和7E11-G2-C12-A10等3株细胞株。采用体内诱生腹水瘤法制备腹水,选用正辛酸-饱和硫酸铵法纯化抗体,获得3种质量较好的抗体,命名为C9、B2和A10。通过间接竞争酶联免疫吸附法（Indirect Competitive Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ic-ELISA）对3种抗体的灵敏度以及特异性进行了初步评价,基于3种抗体建立的ELISA法半数抑制浓度(Half Maximal Inhibitory Concentration,IC50)分别为3.85μg/kg、6.25μg/kg和6.96μg/kg,3种抗体只对马波沙星有交叉反应,表现出较强的特异性。在此基础上,进一步通过ic-ELISA筛选异源包被原作为检测抗原,胶体金作为信号输出载体制备免疫层析试纸条。利用透射电子显微镜（TEM）和紫外-可见分光光度仪（UV-vis）对胶体金和标记探针进行表征,对影响免疫层析试纸条的相关参数进行了工艺优化,具体包括胶体金与抗体偶联时体系的p H、抗体标记量、结合垫探针喷量、T线检测抗原浓度和C线上羊抗鼠抗体浓度等。建立了反应动力学曲线,得到最佳检测时间,通过21种氟喹诺酮结构类似物对所建立方法的特异性进行了评价。该方法在0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS）中的标准曲线为:y=522.735-872.692logx（R~2=0.9983）,线性范围为0.1-2.5μg/kg,最低检出限（Limit of Detection,LOD）为0.169μg/kg。在出入境检验检疫行业标准SN/T5122-2019的基础上对前处理进行了改进,基于鱼肉基质的标准曲线为:y=800.612-1118.694logx（R~2=0.9623）,线性范围为2.5-5μg/kg,LOD为0.254μg/kg,批内和批间回收率分别为87.5%-126%和85.8%-123.2%,变异系数分别为3.1%-11.6%和3.5%-12.0%。基于肉眼判断的定性灵敏度为1μg/kg,通过回收率和双盲检测等实验证实该方法具有很好的准确性。综上所述,本研究建立了一种可以定性定量检测鱼肉中OFL残留的方法,具有灵敏度高、特异性强、准确性好的优势。通过简便的前处理,可以应用于水产品中OFL的现场快速检测。本方法具有广阔的应用前景,有望应用于其它食品安全现场筛查。
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