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目的:①使用人化的选择性结合SIP的单克隆抗体研究其对于RNV、CNV和巨噬细胞的作用。②探索VEGF或EphA2的反义PNAs抑制RNV的作用。③运用缺氧诱导RNV模型作为研究工具来探讨临床重要疾病过程中miRNAs可能起到的作用。④探讨基因ADAM15对于RNV、CNV及视网膜下新生血管(Sub-RNV)形成的作用。⑤探索是否基因SOD1缺失对于在视网膜下形成促血管生成的微环境起到作用,以及是否继发的引起在Bruchs膜和视网膜色素上皮(RPE)上的一些变化进而形成CNV。
方法:⑴8周大小的C57BL/6小鼠眼内注射经放射标记的Sonepcizumab,1、7、14天后分别检测Sonepcizumab进入和从视网膜和脉络膜排出的量。放入75%氧箱后5天,P12天的小鼠返回正常氧浓度并给予一眼内注射3mg Sonepcizumab,另一眼注入磷酸缓冲盐溶液(PBS)作为对照。P17天,检测RNV平均面积和视网膜表面的巨噬细胞数量。⑵制作修饰过的以VEGF或EphA2为靶点的反义PNAs,FITC荧光标记后眼内及视网膜下注射,检测其在视网膜的分布。⑶运用包括miRBase在内的基于网络信息的miRNA作用靶点预测系统来搜索5-和3’-段非翻译区(UTR)预测可能的miRNA作用靶点。⑷运用免疫组化方法来定位ADAM15、PECAM1、PDGFRp在视网膜的表达。使用Real-time PCR方法来分别测试缺氧、rho/VEGF转基因小鼠和野生型小鼠中基因ADAM15 mRNA表达水平。⑸比较SOD1基因缺失和野生型小鼠的缺氧诱导RNV、在Bruchs膜破损处的CNV和VEGF诱导的Sub-RNV面积。
结果:①眼内注射Sonepcizumab可以显著的减少Mφ在缺氧视网膜浸润并且明显减少RNV。在激光诱导CNV小鼠中,眼内注射Sonepcizumab显著减少CNV面积并伴随地减少CNV渗漏。Cynomolgus猴眼内注射Sonepcizumab剂量达1.8μl后四周,视网膜电图、荧光血管造影及眼组织切片结果显示正常并且无组织结构损伤。②眼内注射2μg FITC荧光标记的以VEGF或EphA2为靶点的反义PNAs后,即使视网膜其他区域的染色已经褪去,但是在视网膜血管荧光染色持续存在。③微阵列技术分析表明在缺氧视网膜有7种miRNAs表达明显上升,3种miRNAs(miR-31、-150和-184)表达明显下降。④基因ADAM15缺失的小鼠缺氧诱导RNV、Bruchs膜破损处CNV、VEGF诱导的Sub-RNV面积显著减少。⑤与SOD1+/+比较,SOD1-/-在缺氧视网膜病变和VEGF转基因小鼠模型中产生更多的NV。SOD1-/-小鼠给予抗氧化剂治疗能显著的减少RNV,表明SOD1-/-小鼠由于缺乏抗氧化能力而更容易形成促血管生成的环境。
结论:⑴这些实验数据首次表明S1P可以刺激CNV和RNV生成,而且S1P单克隆抗体Sonepcizumab可能具有治疗CNV和RNV的作用和价值。⑵实验数据表明EphA2信号通路可以促进RNV的生成,而以EphA2及其它内皮细胞受体为靶点的反义PNAs可能具有相对的优势来抑制RNV。⑶数据表明miRNA表达水平的改变可以影响到两种眼底NV(CNV、RNV)的形成。眼内注射或提升某些miRNAs的表达可能是一种很好的潜在的治疗眼底NV的策略。⑷基因ADAM15缺失能通过下调VEGF164和VEGFR2来抑制眼底NV形成,因此基因ADAM15提供了眼底NV的一种全新治疗靶点。⑸数据表明重新激活的氧化产物可以诱导数种眼底NV(RNV、CNV、Sub-RNV),也部分的解释了为什么在年龄相关性眼病的临床试验中,抗氧化剂治疗能够减缓非渗出性年龄相关性黄斑变性(NV-MD)向可以导致严重视力丧失的NV-AMD转变。本研究同时表明抗氧化具有治疗眼底NV相关疾病的巨大前景。