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目的：新生血管性眼病已成为全球范围内仅次于白内障的第二大致盲性眼病，且其致盲比例仍在逐年增加。多巴胺(dopamine, DA)已被证明在肿瘤以及皮肤创伤愈合等模型中的血管新生中发挥着重要作用。而其作为眼内最重要的神经递质之一，在新生血管危害巨大的眼部疾病中是否也有多巴胺系统的参与。本课题聚焦于多巴胺D1受体(dopamine D1receptor, DRD1)，分别在视网膜及脉络膜新生血管模型中用药物干预和基因敲除的方法，明确多巴胺系统中的DRD1是否参与眼底新生血管的形成，并探究其作用的分子机制及其可能参与的细胞类型。
方法：本课题分为三大部分展开：1)明确DRD1在眼底血管新生中的作用。首先明确DRD1拮抗剂SCH39166对视网膜血管新生及脉络膜血管新生的作用：用C57BL/6小鼠分别构建视网膜新生血管模型——氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy, OIR)及脉络膜新生血管模型——激光诱导脉络膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)，每组模型动物又随机分为DMSO溶剂组及SCH39166药物处理组(0.4 mg/kg)，OIR小鼠从P7天进氧舱开始腹腔给药DMSO或SCH39166，每天2次，至P12天出氧舱，取材观察SCH39166对OIR高氧阶段血管发育的作用；或从P12出氧舱开始腹腔注射给药，每天2次，至P17天取材观察SCH39166对OIR低氧阶段视网膜血管新生的作用；CNV模型自造模当天开始腹腔注射给药DMSO或SCH39166，实验7天后取材观察SCH39166对脉络血管新生的作用。其次明确DRD1视网膜敲除对眼底血管新生的作用：用视网膜DRD1特异性敲除小鼠构建OIR模型，P17天取材观察基因敲除DRD1对视网膜血管新生的作用。2)探索DRD1调控眼底血管新生的信号通路。该部分我们将收集上述动物模型的视网膜(OIR模型)，进行蛋白免疫印迹，检测肾素血管紧张素及NO合成两条信号通路中的相关靶蛋白iNOS、eNOS、AT1R、VEGF等的表达。3)探究哪些细胞上的DRD1参与调控眼底的血管新生。首先针对星形胶质细胞，用星形胶质细胞DRD1特异性敲除小鼠构建OIR模型，明确星形胶质细胞上的DRD1是否参与视网膜新生血管的调控；其次用DRD1拮抗剂SCH39166(10-5M)处理1%低氧培养的人视网膜色素上皮细胞(ARPE19)、人视网膜Müller细胞(MIOM1)及视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)24小时后，检测2)中靶蛋白iNOS、eNOS、AT1R、VEGF的表达。借以推测这3类细胞是否通过DRD1参与眼底血管新生的调控。
结果：1)DRD1在眼底血管新生中的作用：首先DRD1拮抗剂SCH39166对视网膜及脉络膜中的血管新生均有显著的抑制作用。SCH39166对小鼠OIR模型高氧阶段的视网膜无灌注区无明显影响，却会增大OIR模型相对低氧阶段的视网膜无灌注区面积(DMSOvsSCH39166∶13.71%±2.64%vs18.73%±3.56%,P=0.0111,independentt-test)，同时还可抑制病理性新生血管的生成(DMSOvsSCH39166∶4.40%±1.24%vs2.29%±0.83%，P=0.0030,independentt-test)；而SCH39166在小鼠CNV模型中，同样可显著抑制新生血管的形成，在用DRD1拮抗剂处理后新生血管的面积可缩小至DMSO溶剂组的45.4%±12.6%(P=0.0276,independentt-test)。其次基因敲除视网膜上的DRD1同样可抑制眼底新生血管的形成：用视网膜DRD1特异性敲除小鼠构的OIR模型与其同窝仔野生型小鼠相比同样表现出了视网膜无灌注区面积的增大(D1flox/floxvsD1flox/floxSix3Cre∶10.53%±2.477%vs14.61%±4.156%,P=0.0076，independentt-test)，及病理性新生血管的减少(D1flox/floxvsD1flox/floxSix3Cre∶5.04%±1.561%vs3.45%±1.066%,P=0.024，independentt-test)。2)DRD1调控眼底血管新生的信号通路：在用SCH39166处理的OIR模型中以及用视网膜DRD1特异性敲除小鼠所构建的OIR模型中，与其相应的对照组相比，实验组均可发现AT1R以及eNOS蛋白表达的降低。3)参与DRD1调控眼底血管新生的细胞类型：首先用星形胶质细胞DRD1特异性敲除小鼠构建的OIR模型中，与同窝仔野生型小鼠相比，其视网膜无灌注区的面积并无显著差异，而病理性新生血管的面积同样受到了抑制(D1flox/floxvsD1flox/floxGFAPCre∶4.36%±0.74%vs2.26%±0.79%，P=0.0199,independentt-test)。其次用DRD1拮抗剂SCH39166处理1%低氧培养的ARPE19、MIOM1HRMEC24小时后，可观察到ARPE19和MIOM1细胞在拮抗DRD1时AT1R及iNOS表达降低，而HUVECs在拮抗DRD1时eNOS表达降低。
结论：DRD1在眼底新生血管的形成中发挥着重要的调控作用。1)药物拮抗或基因敲除DRD1均可显著抑制眼底新生血管的形成；2)拮抗DRD1可通过抑制肾素血管紧张素系统(RAS)的活性及降低一氧化氮(NO)的合成来减少眼底血管的新生；3)星形胶质细胞上的DRD1参与了病理性新生血管的调控，但不影响生理性新生血管的形成。RPE、Müller及血管内皮细胞可能也参与了DRD1调控血管新生的过程，但其作用机制可能并不一致。
方法：本课题分为三大部分展开：1)明确DRD1在眼底血管新生中的作用。首先明确DRD1拮抗剂SCH39166对视网膜血管新生及脉络膜血管新生的作用：用C57BL/6小鼠分别构建视网膜新生血管模型——氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy, OIR)及脉络膜新生血管模型——激光诱导脉络膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)，每组模型动物又随机分为DMSO溶剂组及SCH39166药物处理组(0.4 mg/kg)，OIR小鼠从P7天进氧舱开始腹腔给药DMSO或SCH39166，每天2次，至P12天出氧舱，取材观察SCH39166对OIR高氧阶段血管发育的作用；或从P12出氧舱开始腹腔注射给药，每天2次，至P17天取材观察SCH39166对OIR低氧阶段视网膜血管新生的作用；CNV模型自造模当天开始腹腔注射给药DMSO或SCH39166，实验7天后取材观察SCH39166对脉络血管新生的作用。其次明确DRD1视网膜敲除对眼底血管新生的作用：用视网膜DRD1特异性敲除小鼠构建OIR模型，P17天取材观察基因敲除DRD1对视网膜血管新生的作用。2)探索DRD1调控眼底血管新生的信号通路。该部分我们将收集上述动物模型的视网膜(OIR模型)，进行蛋白免疫印迹，检测肾素血管紧张素及NO合成两条信号通路中的相关靶蛋白iNOS、eNOS、AT1R、VEGF等的表达。3)探究哪些细胞上的DRD1参与调控眼底的血管新生。首先针对星形胶质细胞，用星形胶质细胞DRD1特异性敲除小鼠构建OIR模型，明确星形胶质细胞上的DRD1是否参与视网膜新生血管的调控；其次用DRD1拮抗剂SCH39166(10-5M)处理1%低氧培养的人视网膜色素上皮细胞(ARPE19)、人视网膜Müller细胞(MIOM1)及视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)24小时后，检测2)中靶蛋白iNOS、eNOS、AT1R、VEGF的表达。借以推测这3类细胞是否通过DRD1参与眼底血管新生的调控。
结果：1)DRD1在眼底血管新生中的作用：首先DRD1拮抗剂SCH39166对视网膜及脉络膜中的血管新生均有显著的抑制作用。SCH39166对小鼠OIR模型高氧阶段的视网膜无灌注区无明显影响，却会增大OIR模型相对低氧阶段的视网膜无灌注区面积(DMSOvsSCH39166∶13.71%±2.64%vs18.73%±3.56%,P=0.0111,independentt-test)，同时还可抑制病理性新生血管的生成(DMSOvsSCH39166∶4.40%±1.24%vs2.29%±0.83%，P=0.0030,independentt-test)；而SCH39166在小鼠CNV模型中，同样可显著抑制新生血管的形成，在用DRD1拮抗剂处理后新生血管的面积可缩小至DMSO溶剂组的45.4%±12.6%(P=0.0276,independentt-test)。其次基因敲除视网膜上的DRD1同样可抑制眼底新生血管的形成：用视网膜DRD1特异性敲除小鼠构的OIR模型与其同窝仔野生型小鼠相比同样表现出了视网膜无灌注区面积的增大(D1flox/floxvsD1flox/floxSix3Cre∶10.53%±2.477%vs14.61%±4.156%,P=0.0076，independentt-test)，及病理性新生血管的减少(D1flox/floxvsD1flox/floxSix3Cre∶5.04%±1.561%vs3.45%±1.066%,P=0.024，independentt-test)。2)DRD1调控眼底血管新生的信号通路：在用SCH39166处理的OIR模型中以及用视网膜DRD1特异性敲除小鼠所构建的OIR模型中，与其相应的对照组相比，实验组均可发现AT1R以及eNOS蛋白表达的降低。3)参与DRD1调控眼底血管新生的细胞类型：首先用星形胶质细胞DRD1特异性敲除小鼠构建的OIR模型中，与同窝仔野生型小鼠相比，其视网膜无灌注区的面积并无显著差异，而病理性新生血管的面积同样受到了抑制(D1flox/floxvsD1flox/floxGFAPCre∶4.36%±0.74%vs2.26%±0.79%，P=0.0199,independentt-test)。其次用DRD1拮抗剂SCH39166处理1%低氧培养的ARPE19、MIOM1HRMEC24小时后，可观察到ARPE19和MIOM1细胞在拮抗DRD1时AT1R及iNOS表达降低，而HUVECs在拮抗DRD1时eNOS表达降低。
结论：DRD1在眼底新生血管的形成中发挥着重要的调控作用。1)药物拮抗或基因敲除DRD1均可显著抑制眼底新生血管的形成；2)拮抗DRD1可通过抑制肾素血管紧张素系统(RAS)的活性及降低一氧化氮(NO)的合成来减少眼底血管的新生；3)星形胶质细胞上的DRD1参与了病理性新生血管的调控，但不影响生理性新生血管的形成。RPE、Müller及血管内皮细胞可能也参与了DRD1调控血管新生的过程，但其作用机制可能并不一致。